總有機碳檢測法在五味子提取清潔驗證中的應用

徐婷 陶金 岳鐳

摘 要：為了證明總有機碳（total organic carbon， TOC）檢測法可用于中藥材五味子提取設備的清潔驗證。采用淋洗法與擦拭法取樣，并驗證TOC檢測法的線性、精密度與準確度、檢測限（LOD）與定量限（LOQ）、取樣回收率與穩(wěn)定性，評價總有機碳法用于中成藥清潔驗證的效果。結果表明，五味子濃度（x）在0.024～0.960 mg/L范圍內時，其與TOC值（y）呈良好的線性關系，回歸方程為y=218.8x-0.033，r2=0.999；精密度與準確度的相對標準偏差（RSD）均不超過4%；檢測限（LOD）為3.84μg/L，定量限（LOQ）為11.5 μg/L；采用兩種方式取樣，在低、中、高濃度淋洗法平均取樣回收率分別為63.91%、81.00%、81.11%，擦拭法平均取樣回收率分別為87.50%、83.33%、106.94%；樣品溶液分別在0、4、8、24、28、48 h進行TOC檢測，RSD為5.21%；應用于生產中減壓濃縮罐設備殘留量計算，結果符合限度濃度要求。TOC法可用于五味子提取生產清潔驗證，可廣泛應用于多活性成分的中藥制藥生產。

關鍵詞：總有機碳檢測法，五味子，清潔驗證，擦拭法取樣，淋洗法取樣

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.19.038

Application of Total Organic Carbon Method in Cleaning Validation for Extraction of Schisandra chinensis

XU Ting TAO Jin YUE Lei*

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals）

Abstract： To prove that the total organic carbon （TOC） method can be applied in cleaning validation （CV） for extraction of Schisandra chinensis. Sampling by rinsing and swabbing methods the TOC method was verifi ed for linearity， precision and accuracy， limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ）， sampling recovery rate， stability， which was used for evaluating the effectiveness of facilities cleaning of Chinese patent medicine. The Schisandra chinensis extract concentration（x） at a range of 0.024～0.960 mg/L showed good linear relationship to TOC value （y）， of which the linear regression equation was y=218.8x-0.033， r2=0.999. Both the RSDs in accuracy and precision tests were less than 4%. LOD was 3.8 μg/L， LOQ was 11.5 μg/L.Sampling by two methods， the average sampling recoveries of rinsing method at low， medium and high concentrations were 63.91%， 81.00% and 81.11% respectively， and those of swabbing method were 87.50%， 83.33% and 106.94% respectively. The test solutions were detected at 0， 4， 8， 24， 28， and 48 h respectively by TOC method， with RSD of 5.21%. When applied in the production， the residual concentration of vacuum concentration tank residues were lower than allowable level. The TOC method can be used for CV of Schisandra chinensis extract， which means that it can be widely used for CV of traditional Chinese medicine production with complex components.

Keywords： total organic carbon （TOC） method， Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.， cleaning validation， swabbing sampling， rinsing sampling

0 引 言

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，習稱“北五味子”，收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）[1]與2012年《可用于保健食品的物品名單》[2]中，五味子中目前已知的活性成分達203種[3-4]，主要成分有五味子醇甲[5]、五味子甲素、五味子乙素等木質素類成分[6]，萜類[7]，揮發(fā)油[8]，多糖、黃酮類[9]及有機酸[10]等。

《藥品生產質量管理規(guī)范》（Good Manufacturing Practice，GMP）要求企業(yè)對制藥設備進行有效清洗以最大限度防止藥品污染和交叉污染[11]，為保證清洗后的設備中各種殘留物的總量低至不影響共線產品規(guī)定的療效、質量和安全性，需要對設備進行清潔驗證[12]，即通過科學的方法采集足夠的數(shù)據，以證實按規(guī)定方法清潔后的設備，能始終如一地達到預定的清潔標準[13]。

五味子提取后設備清潔殘留成分多、限度低于目視標準（1～4 μg/cm2），難以界定溶解度最小或顏色最深的目標化合物[14]，新興起的總有機碳（total organic carbon，TOC）法[15]可檢測到所有含碳化合物，結果以碳的質量濃度表示，包括清潔劑乙醇等都能被檢出，該法檢測范圍廣，靈敏度高，檢測時間短，更適用于中藥生產過程清潔驗證[16-18]。

1 儀器與材料

GE Sievers M9 型總有機碳TOC分析儀（美國通用電氣GE公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多METTLER TOLEDO 儀器上海有限公司）；五味子（批號J200301，上海真仁堂藥業(yè)有限公司）；蔗糖對照品（批號111507-202105，中國食品藥品檢定研究院）；1，4對苯醌對照品（批號101197-201904，中國食品藥品檢定研究院）；超純水（實驗室自制，Millipore A10水純化系統(tǒng)）。

2 方 法

2.1 系統(tǒng)適用性實驗

2.2 線性

用超純水溶解60 mg五味子浸膏，并定容至500 mL，配置濃度為120 mg/L的標準儲備液體，再用超純水稀釋至質量濃度分別為0.024、0.060、0.120、0.240、0.480、0.960 mg/L的溶液，以超純水為空白對照，分別進行TOC檢測，重復測定TOC結果的平均值（μg/L）作為y值，以五味子質量濃度（mg/L）為x值，進行線性回歸，計算相關系數(shù)（r2）。

2.3 精密度與準確度

將上述質量濃度分別為0.24 mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L的樣品溶液再進行TOC檢測，重復測定9次，計算RSD，9次檢測結果的平均值與帶入線性方程所得的TOC響應值之比為回收率結果。

2.4 檢測限與定量限

在10個取樣瓶中分別加滿純化水，重復測定3次，計算平均值，由t99（n-1）×SD得到檢測限（Limit of detection， LOD），將檢測限乘以3，得出定量限（Limit of quantitation， LOQ）[18]。

2.5 取樣回收率

2.5.1 淋洗法回收率

吸取56.00 mg/L的五味子樣品溶液6 mL，定量裝入干凈的噴霧器中，分別從閥門的左右兩側均勻噴在管內壁，內表面目視干燥后用700 mL純化水淋洗，在干凈的燒杯中收集淋洗水并檢測其TOC響應值，用扣除背景的TOC響應值代入方程換算出樣品溶液濃度（mg/L），并計算平均濃度（mg/L），除以理論濃度（mg/L）得到淋洗法平均取樣回收率（%），用0.5倍殘留濃度與1.5倍殘留濃度的樣品溶液重復上述實驗。

2.5.2 擦拭法回收率

準備一塊平整光滑的不銹鋼板，在其表面劃出25 cm2×4的區(qū)域，配置濃度為19.20 mg/L的五味子樣品溶液，定量裝入干凈的噴霧器中，在不銹鋼表面上均勻噴灑10 mL溶液，液體不得越過邊界，靜置過夜，自然晾干。取樣人員手部清潔，在目視檢查合格后用分別用兩支TOC專用棉簽進行擦拭取樣，取樣面積為25 cm2。取樣前，棉簽使用少量純化水潤濕，按圖1（a）的路線用棉簽的一側擦拭，盡量覆蓋全部取樣面積，取樣時注意折彎棉簽頭取樣，然后翻轉棉簽使其另一面按圖1（b）的路線進行擦拭，應盡可能采用相同的力度[20]。

將現(xiàn)場取樣擦拭完畢的TOC專用棉簽頭折斷，浸入裝有100 mL純化水的燒杯中，輕搖并放置10 min，使有關物質溶出后測定，用扣除背景的TOC響應值代入線性回歸方程換算出樣品溶液的平均濃度值（mg/L），除以理論濃度（mg/L）得到擦拭法取樣回收率（%），用0.5倍殘留濃度與1.5倍殘留濃度的五味子浸膏溶液重復上述實驗并測定。

2.6 樣品溶液穩(wěn)定性

將質量濃度為0.48 mg/L的樣品溶液保存在常溫環(huán)境中，分別在0、4、8、24、28、48 h測定其TOC響應值，平行測定3次，以其平均值計算RSD。

2.7 方法在車間的應用

3 結 果

3.1 系統(tǒng)適用性實驗

系統(tǒng)適用性實驗的響應效率（R）為94%，在85%～115%之內，符合要求，數(shù)據見表1。

3.2 線性

超純水空白的TOC響應值<0.03 μg/L，當樣品溶液的濃度（x）在0.024～0.960 mg/L范圍內時，其與TOC響應值（y）呈較好的線性關系，標準曲線的回歸方程為y=218.8x-0.033，相關系數(shù)r2=0.999。

3.3 精密度與準確度

樣品溶液在低、中、高濃度對應的回收率在90%～110%范圍內，相對標準偏差分別為3.4%、2.9%，2.1%，表明精密度與準確度好，如表3所示。

3.4 檢測限與定量限

淋洗水的TOC平均值為0.78 μg/L，SD為1.09μg/L，LOD=SD×t99（n-1）=1.09×3.52=3.84 μg/L，LOQ=3SD×t99（n-1）=11.5 μg/L。

3.5 取樣回收率

3.5.1 淋洗法回收率

0.24 mg/L（0.5倍殘留濃度）、0.48 mg/L（1.0倍殘留濃度）、0.72 mg/L（1.5倍殘留濃度）的淋洗水樣品平均回收率分別為63.91%、81.00%、81.11%，淋洗法取樣回收率均大于60%，見表4。

3.5.2 擦拭法回收率

0.24 mg/L（0.5倍殘留濃度）、0.48 mg/L（1.0倍殘留濃度）、0.72 mg/L（1.5倍殘留濃度）的擦拭樣品溶液平均回收率分別為87.50%、83.33%、106.94%，見表5。

3.6 穩(wěn)定性

放置了48 h的樣品溶液分別在6個時間段進行TOC檢測，RSD為5.21%，樣品送檢后應在48 h內完成檢測。供試品溶液穩(wěn)定性驗證如圖3所示。

3.7 方法在車間的應用

分別根據減壓濃縮罐設備與干燥設備清洗后的樣品溶液TOC響應值，代入線性公式折算，所得樣品溶液濃度均小于標準限度濃度，說明減壓濃縮罐與干燥設備中五味子浸膏的殘留量符合限度要求。

4 討 論

中藥設備清潔方法驗證是對生產取樣人員操作、棉簽選擇、溶劑選擇等的全面模擬考察，進行方法驗證時保證擦拭取樣人員與車間生產取樣人員一致，若無法保證，可考察不同人員擦拭后的效果，TOC檢測法應使用專用棉簽，避免棉簽影響取樣回收率，擦拭溶劑應與取樣溶劑一致，注意擦拭溶劑不應干擾TOC檢測結果。

取樣方面，對于易擦拭的設備表面采用棉簽擦拭法，對于不易擦拭的表面及衛(wèi)生球閥采用淋洗法，僅在0.24 mg/L的濃度時，淋洗法取樣平均回收率<70%，其余擦拭法與淋洗法平均回收率在80%～110%范圍內，當兩種取樣方法均適用時建議優(yōu)先采用擦拭法，尤其在指標成分含量極低時，擦拭法取樣回收率更好，回收率不符合要求的主要原因包括人員擦拭力度不夠、擦拭路徑未包含全部取樣面積、棉簽與取樣表面的接觸角度過大導致接觸面積不足等。

在藥品生產設備清潔過程中，一般選擇溶解度小、毒性高的指標成分進行驗證，對于不含毒性成分且有效成分殘留含量極低的中藥產品，TOC法凸顯優(yōu)勢，該法能更全面檢測中藥品種中多指標成分的殘留量，具有很大的應用空間。本次驗證TOC法檢測限低至3.8 μg/L，且樣品檢測耗時僅10 min，檢測時間短、靈敏度高，樣品溶液質量濃度與TOC響應值呈現(xiàn)良好的線性關系，r2=0.999，檢測精密度好、準確可靠，穩(wěn)定性考察結果表明樣品溶液較為穩(wěn)定，可至少放置48 h。但TOC法檢測也有一定的局限性，其僅能檢測水溶性物質的碳含量，且清洗要求高，檢測結果易受殘留物影響。

5 結 論

以五味子提取設備清潔為例采用TOC法檢測中藥生產設備的清潔殘留濃度，該方法操作簡便、靈敏度高、準確度和精密度好，更適用于基質復雜、指標成分含量低于1 mg/kg的中藥生產設備清潔驗證，通過建立科學合理的清潔驗證檢驗方法，滿足不含毒性成分的中藥產品中低濃度、多指標組分的檢測要求，為中藥制劑生產清潔驗證工作提供方法學研究參考。

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作者簡介

徐婷，碩士，主要從事中藥標準化研究。

岳鐳，通信作者，高級工程師，主要從事中藥生產及質量管理研究工作。

（責任編輯：袁文靜）