探索MALDI-TOF MS在肺炎克雷伯菌同源性分析中的應用*

張嘉文 吳森泉 周曉玲 陳惠霞 廖玉婷

南方醫科大學附屬東莞人民醫院，廣東省東莞市 523000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN)是臨床分離及醫院感染的常見致病菌，根據2019年全國細菌耐藥監測報告，它已位列全國前五[1]。由它引起的醫院感染率呈現逐年上升的趨勢，同時多重耐藥菌株的出現往往容易造成患者的病程遷延，甚至導致臨床抗菌藥物治療的失敗[2]。因此，醫院感染的及時發現、篩查和阻斷傳播途徑，能有效降低病人治療過程中的風險。目前基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(Matrix．assisted laser resolutionu ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作為快速篩選菌株種屬的新工具，具有高通量、時效高、誤差小、性價比高等優勢[3]，配合SARAMIS軟件分析菌株間的相似性來分型，可用于同源性的分析比較。本研究應用MALDI-TOF MS對我院5個月內出現的醫院感染KPN菌株進行同源性分析，以脈沖場凝膠電泳(PFGE)獲得的結果作為參考，對MALDI-TOF MS方法進行評價；隨后進一步采集5個月內所有KPN的質譜圖數據，探索該技術在醫院感染控制中作為初篩排查技術的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：收集我院2020年9月—2021年1月臨床分離的KPN非重復菌株218株，其中經過臨床診斷符合醫院感染22株菌。質控菌株：大腸埃希菌 ATCC8739，沙門氏菌標準菌株H9812。所有菌株均以-80℃保存。

1.1.2 儀器與試劑：DENSIMAT比濁儀、VITEK MS質譜儀、CHCA基質液、48孔靶板購自法國Bio-Merieux公司，血瓊脂培養基購自鄭州安圖生物，CHEF系列電泳儀購自美國Bio-Rad Laboratories公司、PFGE電泳儀及成像儀源自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養：將菌株從-80℃冰箱取出，以分純形式分批接種至哥倫比亞血瓊脂平板上后，放入37℃溫箱培養24h。先選取22株院感KPN菌株進行分純培養，所得新鮮菌落將采用MALDI-TOF MS和PFGE分別分析同源性。然后對218株KPN菌株進行2次獨立的MALDI-TOF MS重復實驗，將菌株按48株/批進行分批分純培養及上機實驗。盡量保證每批次菌株的生長環境、培養時間、質譜儀操作時間接近，減少誤差[3]。

1.2.2 MALDI-TOF MS分析同源性：挑單個菌落，采用直涂法[4]，置48孔靶板標本孔上，最后挑ATCC8739單一菌落，分別均勻涂抹在校準靶孔上，用于圖譜校準。分別加1μl CHCA液覆蓋靶孔上晾干，運用MALDI-TOF MS自帶的RUO系統，選擇線性、正離子模式，儀器狀態為質荷比2 000～20 000Da，頻率50Hz。將數據導入至SARAMIS Premium軟件對目標菌株進行圖譜分析。在Show Taxonomy界面，進行SuperSpectrum分析，根據聚類相似性系數，得到進化樹分型。

1.2.3 PFGE分析：按照美國疾病控制與預防中心PulseNet 提供的 PFGE相關標準化操作程序，對22株醫院感染菌株進行同源性分析[5]。經過膠塊制備、細胞裂解、染色體DNA的酶切、加樣和電泳、染色、脫色，最終獲得成像。將PFGE圖像錄入BioNumerics軟件，根據統一的分子質量標準進行校準，標定各圖像條帶的位置。分子量標準為H9812經過Xba I酶切后的片段。根據圖像條帶間的相似性系數，以非加權配對算術平均法構建聚類樹[6]。

1.3 統計學方法 使用SPSS25.0統計軟件進行數據處理分析，采用卡方檢驗比較MALDI-TOF MS和PFGE分析兩種方法的關聯性。使用列聯系數衡量兩者的關聯程度，當P<0.05時認為有統計學意義。

2 結果

2.1 PFGE結果 22株院感KPN菌株經過PFGE聚類分析，得出同源性分析樹狀圖，PFGE的分型見圖1。根據PFGE結果，22株KPN可以分為A～D 4個聚類型，其中A、B細分1～2兩個亞型，分別為A1(4株)、 A2(3株)、 B1(3株)、 B2(10株)、C(1株)、D(1株)。

圖1 22株醫院感染KPN的PFGE電泳圖及同源性分析結果

2.2 MALDI-TOF MS結果

2.2.1 MALDI-TOF MS與PFGE對比分析：將22株醫院感染KPN菌株的質譜數據，采用SARAMIS軟件的相似性分型功能進行分析(見圖2)。與PFGE檢測結果對比，MALDI-TOF MS的結果為：(1)相似性介于98%～100%的菌株有11株，為PFGE-A型3株(含A2型2株，占66.7%)和B型8株(含B2型7株，占87.5%)；(2)相似性介于94%～98%的菌株有7株，為PFGE-B型5株和A2型、C型各1株；(3)相似性介于90%～94%的菌株有3株，均為PFGE-A1型；(4)相似性<90%的為D型(1株)；見表1。經χ2檢測，χ2=41.343，P=0.000，列聯系數=0.808。可認為兩種同源性分析方法間有關聯，且具有統計學意義；同時，列聯系數越接近1，則認為兩者的關聯性越高。

圖2 22株醫院感染KPN的MALDI-TOF MS相似性分型結果

表1 MALDI-TOF MS與PFGE的同源分析結果比較

2.2.2 MALDI-TOF MS 臨床標本初篩情況：對218株KPN共進行了3次MALDI-TOF MS檢測實驗。第1次同源性分析數據是臨床分離鑒定時獲得的蛋白質量指紋圖；而第2次、第3次的數據是菌株在同一復蘇環境和培養時間下，分別進行的2次獨立重復實驗所獲得的蛋白質量指紋圖。3次同源性分析結果顯示，相似性>90%的菌株數分別為77、69、71。出現2次或以上結果一致的菌株有28株，其中包含所有醫院感染菌株(共22株)。

3 討論

近年來，醫院感染問題已引起醫學界的廣泛關注，它的出現會增加病人的痛苦，延長病人的住院時間，增加病人和國家的經濟負擔；影響醫院的正常診療、增加治療的風險[7]。而流行病學調查是預防和阻斷院內感染傳播、暴發的最有效手段。當院內出現疑似病例時，常采用同源性分析方法來追蹤病原體。

現今，PFGE技術是同源性分析的金標準[8]，它具有較高的精確度和穩定性，但由于操作較煩瑣、耗時長、費用高等缺點，難以被普通醫院作為常規技術開展使用。最近MALDI-TOF MS作為一種快速鑒定病原菌種屬的新技術在廣大醫院逐漸得到普及[3，9]，它能通過分析菌株間蛋白豐度的相似程度，從而快速獲得細菌同源性。張杰、王媛媛、李鑫等[9-11]多個國內研究團隊已證實MALDI-TOF MS技術可應用于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的同源性分析。但該類菌只是日常臨床分離細菌的極少一部分，而且國內應用MALDI-TOF MS技術進行大樣本的檢測實驗較少[12]。本研究通過與PFGE技術做對比，探索MALDI-TOF MS應用在KPN同源性分析中的可行性；另一方面通過大樣本檢測，評估該技術作為監測醫院感染KPN初篩方法的應用價值。目的為醫院感染管理找到可靠、快速、高通量的初篩菌株方法，從而更好地服務臨床，盡早發現醫院感染，有效預防細菌傳播和暴發。

根據MALDI-TOF MS 與PFGE 檢測結果的對比分析顯示，除274號標本的PFGE結果無法出現清晰條帶外，其余21株醫院感染菌株MALDI-TOF MS相似性均>90%。可認為相似性>90%的菌株為高度同源性菌株，該結論與張杰、李鑫等[9，11]的研究結論一致。本研究中，醫院感染菌株的MALDI-TOF MS相似性分別在90%～94%、94%～98%、98%～100%間出現菌株高度集中，可將菌株分為3組：相似性為90%～94%的菌株均為PFGE-A1型；相似性為94%～98%的菌株主要以PFGE-B型為主(71.4%)，但不能區分B1、B2兩種亞型；相似性為98%～100%的菌株主要以PFGE-B2型為主(63.6%)。MALDI-TOF MS與PFGE的結果經醫學統計學的卡方檢驗分析后，獲得P<0.000，列聯系數為0.808。列聯系數在χ2統計中為相關性測量值，值的范圍在0～1，而且越接近1的值表示變量之間的相關度越高。因此，可認為兩種同源性分析方法間有關聯，且具有統計學意義。即MALDI-TOF MS技術可作為醫院感染KPN同源性分析的快速檢測方法，能較好反映醫院感染菌株的流行趨勢。

然而MALDI-TOF MS技術仍存在部分弊端。在本研究中，PFGE-A2與B2亞型菌株的MALDI-TOF MS相似性均為100%，出現相同的檢測結果，由此，表明MALDI-TOF MS技術的特異性不足，無法明確區分菌株的亞型。因此，在MALDI-TOF MS技術的臨床應用中，經篩查得出高度懷疑的醫院感染菌株，應引起重視，必要時采用PFGE方法進行確認。檢測部門在做好預防醫院感染暴發的同時，也要防止結果的誤報[13]。

此外，本研究采用MALDI-TOF MS技術進行大樣本的檢測實驗，對218株臨床分離KPN進行重復檢測實驗。根據前文的實驗結論，將MALDI-TOF MS相似性>90%的菌株納入高度同源組。在3次重復實驗中，檢測獲得高度同源組的菌株數量相差較少，有28株菌株出現2次或以上結果一致，其中包含了被臨床確診為醫院感染的22株KPN。在屈晨虹、陳峰、田月如等[3-4，12]研究團隊指出，MALDI-TOF MS的檢測結果易受客觀因素影響，如菌株的培養條件、前處理操作方法等等。而本研究在盡量保證菌株的培養條件一致的情況下，使用相同的操作方法進修重復實驗，結果表明MALDI-TOF MS技術具有較好的實驗重復性。本研究結論認為，MALDI-TOF MS在臨床應用中可作為初篩技術對臨床分離KPN進行逐級篩查。首次的MALDI-TOF MS實驗可獲得約35.3%(77/218)的高度同源組菌株；再次，對高度同源組菌株進行第2、3次重復實驗，出現2次或以上結果一致的菌株便可認為是高度懷疑的醫院感染菌株；隨后，結合臨床診斷及其他方法學技術對高度懷疑菌株進行進一步篩查及確診。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術具有快速、高通量、實驗重復性較好的特點，與PFGE技術的菌株分類基本一致，可作為醫院感染控制的初篩排查技術，在一定程度上能快速追根溯源，增強院內病原菌流行防控的時效性。但其實驗的特異性仍存在不足，單次的檢測結果可能出現疏漏，仍需結合臨床診斷和更準確的同源性分析技術明確流行規律，從而采取適當措施，嚴格控制醫院感染的進一步暴發。MALDI-TOF MS作為新技術廣泛應用于其他臨床菌株的同源性分析，仍需更深入的實驗研究。