基于高分辨率熔解曲線分析技術探討TNF-α基因多態性與銀屑病的相關性*

王英俊 王蒙昕 惠海珍 史丙俊 江 雪 龔 娟 戚東衛

1 重慶市中醫院皮膚科 400011； 2 貴州中醫藥大學

銀屑病(Psoriasis)是一種由多基因調控的慢性炎癥性皮膚病，臨床上以鱗屑性紅斑、斑塊為主要表現。銀屑病因地區、種族、環境等影響因素不同，在全球的發病率差異較大，流行病學調查表明，我國總體患病率整體約為0.47%，且逐年上升[1]。其中遺傳因素在銀屑病的發病過程中有著重要影響，全基因組關聯分析(GWAS)報道約有50多個易感基因與銀屑病相關。相關研究證實銀屑病的發病與IL-23及Th17信號通路有關，而腫瘤壞死因子α(TNF-α)是IL-23/Th17信號通路上重要的參與基因，且在銀屑病患者的血清和皮損中均有異常表達[2]，因此檢測分析TNF-α基因多態性在銀屑病的發病過程中的重要作用對銀屑病的認識及研究具有重要意義。高分辨率熔解曲線(High resolution melting，HRM)分析技術主要用于含突變位點DNA基因的檢測，該技術以普通聚合酶聯反應(Polymerase chain reaction,PCR)為基礎，通過檢測DNA雙鏈的解鏈溫度變化來檢測DNA序列的改變。因其較好的特異性和靈敏性、操作簡單、成本低等優點，目前已廣泛應用于檢測基因突變和基因分型。本研究擬采用HRM技術對銀屑病患者和正常人的TNF-α基因位點突變的檢測，并以測序法進行驗證，分析該位點與銀屑病的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年1月—2019年5月在我院住院部及門診就診的銀屑病患者426例作為研究組，其中男290例，女136例，平均年齡(36.47±19.08)歲。對照組為我院體檢中心健康人485例，其中男304例，女181例，平均年齡(35.25±17.84)歲，對照組各項指標均正常。本研究已通過重慶市中醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。所有研究對象均無血緣關系。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：臨床表現及皮膚病理檢查符合銀屑病特點的患者。(2)排除標準：患有類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及皮肌炎等自身免疫性疾病，銀屑病家族史，高血壓、心臟病、糖尿病等慢性系統性疾病。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提?。喝∈茉囌呖崭?h以上靜脈血2ml置于EDTA抗凝采血管，并于4h內開始DNA提取。根據重慶美基生物技術有限公司提供的試劑盒說明書步驟提取外周血DNA。最后使用OneDrop儀器對DNA純度及濃度進行檢測。

1.3.2 引物的設計與合成：根據NCBI查找基因序列，采用primer3 input在線軟件設計rs3093662位點單核苷酸多態性的擴增引物，其上游引物為：5’-GCCAGCCTTCATCCACTCT-3’；下游引物為：5’-CCCACTGCTTCCATACCG-3’。引物由武漢莫納生物科技有限公司合成。

1.3.3 PCR-HRM檢測：反應體系采用MonAmpTMFast SYBRGreen qPCR Mix (None/Low/High ROX)，反應體系包括MonAmpTMFast SYBRGreen qPCR Mix 10μl，正向引物(10μM)a0.4μl，反向引物(10μM)a0.4μl，DNA模板b1μl，加Nuclease-Free Water至20μl，PCR-HRM檢測在Light Cyder480熒光定量PCR儀上完成。擴增條件為預變性95℃ 30s，進入循環，變性95℃ 1～5s，退火&延伸 55～60℃ 1～5s，并采集熒光，40個循環；HRM檢測條件為: 95℃ 1min，40℃ 1min，以1℃/s的溫度上升速率從70～95℃收集熔解曲線數據，40℃冷卻。依據標本熔解曲線峰型分析各基因型，并隨機挑選3個不同特征峰的PCR產物送至武漢莫納生物科技有限公司進行測序驗證。

1.3.4 測序驗證：所有擴增產物送至武漢莫納生物科技有限公司進行測序，測序后運用Chromas軟件進行突變堿基的查找。

1.4 統計學方法 運用Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡定律對理論頻數和實際頻數進行檢驗，最后應用SPSS22.0統計軟件對兩組基因型及等位基因頻率進行分析。研究組和對照組的基因型和等位基因頻率進行χ2檢驗，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

TNF-α基因 rs3093662位點的基因分型及測序驗證結果如圖1所示，該結果經驗證與PCR-HRM檢測SNP結果一致。檢測結果如表1所示，rs3093662的AG、AA、GG基因型頻率在銀屑病研究組和對照組中存在統計學差異(χ2=4.661，P=0.03)，A、G等位基因頻率在銀屑病研究組和對照組中存在統計學差異(χ2=4.518，P=0.03)。

圖1 TNF-α rs3093662基因分型分析

表1 TNF-α基因rs3093662單核苷酸多態性結果

3 討論

雖然銀屑病的發病機制還不清楚，但是有研究顯示，銀屑病的發生、發展、轉歸與細胞免疫密不可分，其發病風險涉及免疫系統的多個領域[3]。TNF-α基因位于人體第6號染色體6p21.3上，該染色體存在于組織相容性復合體(MHC)區域內，在MHC區域內的基因大多編碼免疫防御相關蛋白，其中編碼TNF-α基因位于MHC類區域的6號染色體內[4]。TNF-α是由激活淋巴細胞響應各種刺激產生的，在銀屑病免疫炎癥反應中起著重要作用，它可以刺激NF-κB信號通路，影響血管內皮生長因子的表達，促進角質形成細胞的增殖、分化，釋放炎癥介質參與炎癥反應[5]。隨后發現TNF基因是銀屑病的獨立易感因子，參與IL-23/Th17通路的炎癥反應過程[6]。TNF-α基因多態性大多由其啟動子區域決定，并影響著人類疾病的易感性和嚴重性[7]。有研究報道在銀屑病患者與對照組之間，TNF-α基因啟動子-308(rs1800629)多態性方面存在顯著差異，G等位基因和GG基因型在患者組多于對照組，表明GG型存在銀屑病風險[8]。在朱俊卿等的Meta分析中，驗證了TNF-α-308A/G的突變基因型和等位基因是銀屑病發病的保護因素。反之，TNF-α-238A/G突變基因型和等位基因增加了銀屑病的發病風險[9]。目前TNF-α基因單核苷酸多態性位點與銀屑病的相關性已被多項研究證實。王文菊等人參與的文獻通過對漢族人銀屑病易感基因TNF rs3093662的研究，發現TNF、IL-21和CCR4三個基因組成的交互作用模式與銀屑病易感性相關[6]。

HRM分析技術作為一種基因分型技術，其原理是通過擴增含突變位點的基因，雙鏈DNA在升溫過程中由于突變位點不匹配而解開，熒光染料從解鏈的DNA上釋放，釋放時間不同，熒光強度也不同，以及圖形變化上就可以判斷是否存在突變位點[10]，該技術完美地結合了PCR擴增技術與熔解曲線分析技術。近年來HRM分析技術因為有著結果準確性較高、操作簡單、成本低等優點，在基因分型、突變掃描、序列匹配等方面都得到了全面應用。

本研究采用HRM分析技術對TNF-α基因rs3093662位點進行檢測分析，結果顯示426例樣本中，rs3093662的G等位基因頻率明顯高于對照組，表明TNF-α基因rs3093662位點多態性可能與銀屑病發病相關，且G等位基因可能為危險基因。因此，加強對TNF-α基因多態性的研究對銀屑病分子生物學遺傳機制闡述十分必要。盡管這些研究結果與本次不盡相同，考慮可能與TNF-α基因多態性在不同種族、環境及遺傳背景下具有差異性相關。TNF-α基因多態性與銀屑病發病的相關性仍需大樣本、多種族、多區域進一步深入研究。

綜上所述，采用HRM技術對銀屑病患者TNF-α基因rs3093662位點進行分析，確立了操作簡單、結果準確、耗時短的SNP分型方法，研究表明TNF-α基因rs3093662多態性與銀屑病發病密切相關。HRM分析技術操作簡單，檢測快速，準確性高，檢測成本低，適合在臨床檢測中推廣應用。