高遷移率族蛋白1對失血性休克大鼠缺血再灌注后腸屏障功能影響

王鑫宇，李 達，高廣榮，馬 銳，張 成，柳云恩

1.錦州醫科大學 北部戰區總醫院 研究生培養基地，遼寧 沈陽 110016；2.北部戰區總醫院 普通外科，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽醫學院，遼寧 沈陽 110034

盡管，通過損傷控制性手術輔以合理的液體復蘇策略，可使多數失血性休克(hemorrhagic shock，HS)患者得到成功救治，但仍有部分患者因循環衰竭或多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)死亡[1-2]。既往研究報道，腸黏膜對缺血較為敏感，是缺血-再灌注損傷時最易受累的器官[3]。其中，值得關注的是，盡管在合理液體復蘇的支持下，仍有部分患者的腸上皮因無氧代謝和乳酸中毒而受損，導致屏障功能受損，引起大量炎性介質過度釋放及細菌移位，最終發生MODS等嚴重并發癥。在復蘇期間采取誘導性低溫(inducible hypothermia，IH)可以明顯改善HS引起的有氧代謝紊亂及炎癥反應，是改善HS患者預后、降低病死率的一種重要治療手段[4-5]。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box-1，HMGB1)已經被證實是一種能參與炎癥反應的重要介質[6]。在應激狀態下，HMGB1可作為細胞早期警報素，啟動損傷相關分子機制，后期在氧化應激等刺激條件下，HMGB1可以從胞核中通過胞漿分泌到細胞外，促進炎癥反應，加重組織缺血再灌注損傷。然而，其在HS條件下是否同樣能誘發腸道炎性因子釋放，損傷腸道屏障，目前相關報道較少。因此，筆者從HS發病的分子生物學角度著手，意圖探究HMGB1是否具有調控HS鼠腸道細胞、損傷腸道屏障功能作用，為臨床發展針對性治療及研發新型藥物奠定理論基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 成年Wistar大鼠[體質量180～200 g，平均體質量(189.0±5.7)g])，由北部戰區總醫院動物實驗室提供；低溫離心機(沈陽醫療器械有限公司)；BL-420E多導聯生理記錄儀(成都金鳳有限公司)；壓力傳感器(新加坡Biosensors公司)；動物肛溫計(北京冀諾泰科技發展有限公司)；大鼠手術器械(沈陽醫療器械有限公司)；聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(德國Biometra公司)；紫外線分光光度計(英國UV-visible Spectrometer公司)；血氣分析儀(德國Bayer公司)；熒光定量PCR試劑盒(北京寶日醫生物有限公司)；HMGB1引物合成(上海生工生物工程有限公司)；HMGB1抗體(英國Abcam公司)。

1.2 大鼠HS模型的建立 Wistar大鼠32只，隨機分為常溫復蘇(N)組和低溫復蘇(H)組，每組各16只。以10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，進行氣管插管輔助呼吸，分離左股動脈及左頸總動脈，分別用于放血及監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，左股靜脈則用于復蘇時液體回輸。N組和H組放血速度控制在0.5 ml/min，放血量為20 ml/kg，總時間控制在10 min以內，將MAP維持在50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右90 min。抽取的血液儲存于肝素化(7.5 U/ml)注射器中，置于4℃冰箱中保存。

1.3 HS復蘇模型的建立 N組采用加熱設備控制大鼠體溫在38℃，H組采用酒精擦浴等方式控制大鼠體溫在32℃；同時，回輸放出的血液以及3倍放血量的林格液，復蘇結束后恢復H組大鼠的體溫，檢測兩組血流動力學變化。3 h后每組各處死8只大鼠，采集血液、腸系膜淋巴結及小腸標本，剩余鼠用于72 h生存分析。

1.4 定量PCR檢測HMGB1 mRNA表達 RNA提取：將小腸標本搗碎，加入1 ml Trizol后震蕩60 s，加入200 μl氯仿后震蕩30 s，低溫高速離心機離心15 min。取上清液加入等量異丙醇。再次離心15 min后，用75%乙醇清洗，隨后加入40 ml RNase free water混勻，55℃金屬浴5 min。使用紫外分光光度儀檢測mRNA含量。cDNA反轉錄：采用TaKaRa反轉錄試劑盒，制備cDNA。PCR擴增：HMGB1引物序列，forward5-TCTTCCTCTTCTGCTCTGA-3，resever5‘-ATCTTCCTCCTCTTCCTTCT-3′；GAPDH引物序列，forward5-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3，resever5‘-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。根據CT值按照2-△△CT法計算HMGB1在N組和H組中表達的相對水平。

1.5 蛋白印跡法檢測HMBG1等蛋白表達 小腸標本懸液(40 μl)中加入4倍體積的細胞裂解液，12 000 r/min、4℃離心20 min后，收集上清液，使用考馬斯藍法進行蛋白定量。電泳分離樣本后轉移至硝酸纖維膜上，以BSA封閉，以BSA封閉1 h，分別加入HMBG1、Coroin 1A、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、白細胞介素(interleukin，IL)-4、神經絲蛋白-M(Neurofilament-M)、腎連蛋白(nephronection)、IL-17、胰島素樣生長因子-1受體(in sulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、淀粉樣蛋白前體蛋白結合家族A2(the amyloid precursor protein-binding protein A2 gene，APBA2)、IL-10、肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、Bax、CLP、白細胞共同抗原(CD45)及GAPDH的一抗(1∶1 000)，室溫下沉淀1 h，4℃搖晃過夜；次日加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體(1∶2 000)，于室溫下靜置2 h；最后利用ECL浸膜。采用圖像分析儀對膠片進行分析。

1.6 血清炎性細胞因子檢測 采用酶聯免疫吸附試劑盒檢測大鼠血清中HMGB1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的表達情況。

1.7 小腸細菌移位檢測 將血液及腸系膜淋巴結標本稱重，置于含有0.5 ml磷酸緩沖鹽溶液中研磨，將勻漿按照300 μl/份均勻涂抹在培養基上，置于37℃培養箱中培養24 h，顯微鏡觀測。

2 結果

2.1 HMGB1 mRNA表達 復蘇后3 h，H組和N組小腸組織中HMGB1 mRNA表達均有所升高。H組大鼠小腸組織中HMGB1 mRNA表達水平明顯低于N組，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。表明HS會刺激小腸細胞HMGB1表達升高，但低溫復蘇相比于常溫復蘇能有效降低HMGB1的表達，近而減輕炎癥反應。

圖1 HMBG1 mRNA表達變化

2.2 HMGB1等炎性相關細胞因子蛋白表達 復蘇后3 h，N組和H組大鼠均可見小腸組織中包括HMGB1及多種炎癥相關細胞因子蛋白的表達。其中，H組大鼠小腸組織中HMGB1、IL-4、Neurofilament-M、nephronection、酰基輔酶A氧化酶2(palmitoyl CoA oxidase 2，ACOX2)、IL-17、IGF-1R、APBA2、IRE1α、Bax、CLP和CD45表達明顯低于N組，而Coronin 1A和IL-10表達明顯高于N組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。表明低溫復蘇HS鼠的腸組織HMGB1等相關炎性細胞因子蛋白表達相對下調，抑炎因子表達相對上調，低溫復蘇HS鼠腸道受炎性細胞損傷較輕。

圖2 HMGB1等炎性細胞因子蛋白表達變化

2.3 復蘇大鼠血清炎性因子含量比較 復蘇后3 h，H組大鼠血清中HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明顯低于N組，抑炎因子IL-10高于N組，組間比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。同樣說明低溫復蘇可以降低HMGB1等炎性相關因子的表達。

圖3 N組和H組大鼠血清炎性因子含量比較

2.4 復蘇大鼠腸系膜淋巴結細菌含量比較 H組大鼠腸系膜淋巴結細菌移位個數為2個，平均細菌移位量為(21.34±0.91)×103CFU/ml；而N組大鼠細菌移位個數為5個，平均細菌移位量為(45.25±0.54)×103CFU/ml。兩組平均細菌移位量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。說明低溫復蘇可以減少HS大鼠的腸道細菌移位。

2.5 兩組大鼠生存情況比較 72 h生存分析結果顯示，N組大鼠平均生存時間為(54.6±4.8)h，低于H組的(75.79±3.62)h，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

HS主要表現為患者全身和局部組織灌注明顯不足，即使給予積極的復蘇治療有時也難以糾正患者的休克狀態。而復蘇治療在糾正休克的同時又極易導致部分組織的再灌注損傷，不當的復蘇不僅難以恢復患者的休克狀態，反而會加重其組織器官的損傷。有研究報道，頑固性低血壓和缺血-再灌注損傷可能是影響HS轉歸的直接原因[7]。在眾多難治性HS患者中，學者們發現，腸黏膜對缺血最為敏感，易在缺血期間堆積大量代謝物質，進而誘發急性炎癥反應，而在復蘇治療過程中，大量氧及白細胞會隨著血液流入腸黏膜，最終導致難以控制的全身性炎癥反應綜合征[8]。

在筆者的前期研究中，已經證實了IH能夠有效地提高復蘇效率，改善HS引起的炎癥反應，調整能量代謝平衡[9-10]。實際上，在休克等應激狀態下，腸上皮細胞受損會釋放警報素，啟動炎癥相關分子模式，通過多種模式識別受體如Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)4、糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)等，最終釋放TNF-α、IL-6等炎性細胞因子，損傷腸黏膜屏障。因而，探究缺血-再灌注損傷導致腸屏障功能的分子機制，能為改善HS患者預后提供理論基礎。

HMGB1能在應激狀態下從細胞核中釋放并進行乙酰化修飾，進而介導炎癥反應。有研究報道，在腎發生缺血-再灌注損傷時，HMGB1從腎實質細胞核中大量釋放，乙酰化后作用于下游靶點TLR-2/4等受體，引起多種炎性因子釋放[11]。為了探究HMGB1對HS鼠腸屏障功能是否具有同樣的作用，筆者通過構建N組與H組兩組模型，分別檢測兩組鼠腸上皮HMGB1及其他相關炎性因子的表達情況，結果發現，H組大鼠小腸組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達較N組明顯降低，相關促炎因子也同樣下調，而Coronin 1A和IL-10等抑炎因子表達明顯升高，并且H組大鼠平均細菌移位量也明顯減少，結果證實了，在IH復蘇HS時，大鼠腸上皮細胞核HMGB1表達下調，其向胞質的分泌及乙酰化過程受阻，進而抑制TLR4、RAGE等識別受體，減少炎性因子的釋放，減輕了腸屏障損傷，抑制腸道細菌移位，改善全身炎癥反應綜合征。本研究的結果與眾多HMGB1相關研究結果[12-14]一致，初步明析了HMGB1在IH復蘇中的相關分子機制。但IH時，機體具體通過何種機制導致HMGB1表達下調尚不可知，仍需后續實驗繼續探究。

綜上所述，HMGB1表達下調可能是導致IH減輕大鼠HS腸屏障功能損傷的重要分子機制，為臨床中治療HS及預防缺血-再灌注損傷提供了一定的理論依據。但關于如何在臨床患者中應用HMGB1拮抗劑來應對缺血-再灌注損傷帶來的腸屏障功能障礙，仍需要更多的研究來證實。