NTRK基因融合陽性甲狀腺乳頭狀癌9例臨床病理特征

付 莎,李陽陽,鄭娜芬,萬 歡,王 厥,宋 楊,王海云,歐陽能太

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)約占80%[1]。近年來甲狀腺癌的檢出率呈逐年上升趨勢。甲狀腺癌又稱為“惰性癌”,但有小部分甲狀腺癌易發生侵襲和轉移。酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)編碼基因融合導致配體非依賴性二聚化,激活下游MAPK及PI3K/AKT信號通路,是其發生機制之一,常見融合基因包括RET和NTRK[2]。TCGA數據庫顯示,甲狀腺癌中RET占比最大,其次是NTRK[3]。RET基因融合多見于經典型PTC[4],NTRK基因融合在PTC、嗜酸細胞癌、低分化癌及未分化癌中均有報道[5-6]。在臨床工作中并非每例PTC患者都有條件進行分子檢測,病理醫師如何在日常診斷工作中根據組織學特征篩選出生物學行為較差的PTC患者,對該部分患者行二代測序(next-generation sequencing, NGS)檢測具有非常重要的臨床應用價值。文獻報道RET基因融合的組織學特征與經典型PTC相似,包括乳頭狀結構、毛玻璃樣核、核溝及核內假包涵體等。因受限于檢測方法及發生率低,目前我國PTC患者中關于NTRK基因融合的研究報道不多,靶向藥物的上市使NTRK基因融合檢測更具有臨床價值。本文主要采用NGS檢測PTC中NTRK基因融合狀態,分析其組織學及臨床病理特征,為病理醫師篩選待測標本及臨床治療、預后提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年5月～2022年4月在中山大學孫逸仙紀念醫院行NGS檢測的PTC標本790例,患者均行超聲引導下細針穿刺和手術切除。待測標本均為石蠟組織標本。NGS檢測前均由具有5年以上經驗的病理醫師進行質控評估,為保證NGS檢測結果的可靠性,石蠟標本要求腫瘤細胞數量≥200個,占比≥20%。臨床信息通過電子病歷系統獲取。本實驗經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準。

1.2 病理學參數收集NTRK基因融合陽性PTC標本的臨床病理特征主要包括腫瘤大小、邊界、生長模式及甲狀腺被膜、脈管、神經侵犯與否和頸部淋巴結轉移情況。生長模式包括乳頭狀、濾泡狀、實性/小梁狀/島狀、高柱狀等。細胞特征主要以BRAF V600E突變的經典型PTC為參考,具體包括細胞排列、形狀、體積、細胞質及核染色質改變、核溝及核內假包涵體等。

1.3 NGS檢測待測基因組DNA使用核酸提取純化試劑盒(廣州美基生物公司),DNA濃度及純度檢測使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,美國)。DNA片段化選擇聚焦超聲波破碎儀(Covaris S220,美國),基因文庫構建采用雜交捕獲法。文庫片段的大小分布使用Agilent 2100生物分析儀(安捷倫公司,美國)。質控合格的文庫使用Illumina NextSeq 550測序平臺行雙端測序。測序試劑盒采用甲狀腺癌基因檢測試劑盒(上海睿璟生物公司)。

1.4 免疫組化標本經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,以4 μm厚切片,免疫組化抗體TRK(MXR032,福州邁新公司)和增強DAB染色液(OptiView DAB IHC Detection Kit,羅氏)。免疫組化檢測在全自動免疫組化儀(Roche Benchmark XT,瑞士)進行,采用EnVision兩步法染色。每張玻片均設陰性和陽性對照,免疫組化染色結果由2位具有5年工作經驗的病理醫師進行判斷。按照細胞著色強度分為:強陽性(3+)、中等陽性(2+)、弱陽性(1+)及無著色(0)。

1.5 FISH驗證實驗利用ETV6-NTRK3融合基因t(12:15)探針試劑盒(廣州安必平醫藥公司),FISH主要經過標本預處理、探針預熱變性、探針雜交、洗滌、復染等過程。陽性判讀標準:腫瘤細胞內出現1個或2個黃色信號,且出現黃色信號的腫瘤細胞數量≥15%。

2 結果

2.1 臨床病理特征790例PTC患者中位年齡40歲(范圍8～77歲)。790例PTC患者中NGS檢出的基因變異類型見表1。本組檢出9例NTRK基因融合,包括2例NTRK1和7例NTRK3基因融合,其陽性率約為1.1%。9例NTRK融合陽性PTC中,7例女性,2例男性;中位年齡29歲(范圍27～68歲)。7例NTRK1/3基因融合發生在單側葉,2例發生在雙側葉;腫瘤呈多結節狀分布,最大徑均>1 cm。NTRK1/3基因融合病例具有明顯的局部侵襲、轉移能力,本組7例患者發生頸部淋巴結轉移,9例均侵犯并突破甲狀腺被膜,并浸潤周圍組織,未見脈管及神經侵犯。5例患者接受甲狀腺腺葉切除聯合131I治療,4例僅行甲狀腺腺葉切除,所有NTRK1/3基因融合PTC患者均未接受NTRK靶向藥物治療。中位隨訪時間12.2個月(4.6～27.4個月),隨訪期間未發現腫瘤復發征象(表2)。

表1 790例甲狀腺乳頭狀癌中NGS檢出的基因變異

表2 9例NTRK1/3基因融合陽性甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征及驗證

2.2 NGS檢測及驗證本組9例NTRK1/3基因融合PTC患者融合類型主要包括:7例ETV6-NTRK3(E4:N14)融合、1例TPM3-NTRK1(T8:N12)融合和1例IRF2BP2-NTRK1(I1:N9)融合。9例NTRK1/3融合陽性病例均為伴侶基因提供上游的啟動子序列,NTRK1或NTRK3基因提供下游的激酶結構域(圖1)。根據腫瘤細胞染色強度TRK分為:2例3+、3例2+、3例1+、1例0(圖2 A～C)。2例免疫組化3+標本均為NTRK1基因融合;其余7例0/1+/2+均為ETV6-NTRK3基因融合,但免疫組化顯色欠佳,進一步選擇特異性ETV6-NTRK3融合探針重新檢測,FISH結果顯示7例標本均為ETV6-NTRK3融合陽性(圖2D)。

圖1 NTRK1/3融合陽性的三種變異類型:A. IRF2BP2N-NTRK1(I1:N9)融合;B. TPM3-NTRK1(T8:N12)融合;C. ETV6-NTRK3(E4:N14)融合

圖2 免疫組化和FISH驗證:A. TRK 3+,EnVision兩步法;B. TRK 2+,EnVision兩步法;C.TRK 1+,EnVision兩步法;D. FISH檢測顯示ETV6-NTRK3融合信號陽性(黃色)

2.3 組織學特征與經典型BRAF V600E突變PTC相比,9例NTRK1/3融合標本中2例為濾泡亞型,7例以濾泡結構為主,伴有少量乳頭狀或實體/小梁/島狀生長方式(表2)。腫瘤與正常組織邊界不清,6例(66.7%)呈浸潤性生長,間質伴有纖維化,3例(33.3%)呈多灶性滲透或“跳躍式”浸潤。濾泡狀排列的腫瘤腔內膠體減少,胞質伴透明化改變,腫瘤細胞輕度異型(圖3A、B)。乳頭狀結構常位于癌巢內,乳頭分支少,腫瘤細胞胞質較豐富,部分乳頭中央缺乏纖維血管軸心(圖3C)。4例局部呈實體/小梁/島狀生長趨勢,多位于腫瘤浸潤的邊緣(圖3D)。間質纖維化常位于腫瘤內或被膜處,淋巴細胞浸潤少見(圖3E)。NTRK1/3融合陽性病例具有較強的局部侵襲和轉移能力,在甲狀腺周圍組織及淋巴結內腫瘤細胞以濾泡亞型為主。另外,在4例NTRK1/3融合病例中發現其乳頭狀排列的區域可見細胞拉長,呈柱狀改變,存在核極性反轉現象(圖3F)。

2.4 液基細胞學特征液基細胞學結果顯示,8例診斷為PTC(TBS-Ⅵ類),與術后結果一致;1例診斷為意義不明(TBS-Ⅲ類),術后首次診斷為濾泡性腫瘤,不除外癌變可能。分子檢測結果提示ETV6-NTRK3融合陽性,經會診最終診斷為PTC。本組病例液基細胞學常表現為小片狀,細胞體積不大,毛玻璃樣核不明顯。核膜表面稍不規則,局部輕微凹凸不平,缺乏“桑葚樣”或“葡萄干樣”核膜顯著改變,核溝及核內假包涵體少見(圖4)。

3 討論

腫瘤發生機制常由基因變異或染色體不穩定性導致,PTC的發生主要與MAPK信號通路和PI3K-AKT信號通路激活有關,涉及的基因包括BRAF、PTEN、RAS、TERT和TP53基因突變及RET、ALK、NTRK等基因融合[7-8]。BRAF V600E突變常見于PTC[9],RAS突變多見于PTC及濾泡癌,但良性結節也有報道[10],TP53突變、TERT啟動子突變多發生在低分化或未分化甲狀腺癌[11]。雖然NTRK融合在甲狀腺癌中并不多見,但甲狀腺癌新發病例每年都在增加,深入研究NTRK融合病例的病理特征及生物學行為非常必要。有文獻報道在輻射誘導的PTC中發現ETV6-NTRK3融合發生率約為14%,在散發性PTC中其發生率為1.2%～4%[3,12-14]。本實驗發現甲狀腺癌中發生NTRK融合的概率僅次于RET融合,與文獻報道一致,其他罕見融合基因包括ALK、BRAF等[3,15]。同時本實驗也發現NTRK3基因融合比NTRK1基因融合更常見(7 ∶2)[7-8]。在NGS檢測中觀察到NTRK融合陽性患者的中位年齡為29歲,發病更傾向于年輕人。Zhao等[16]團隊的研究顯示,NTRK基因融合在兒科腫瘤中比在成人腫瘤中更常見,且融合類型更豐富。與經典型PTC相比,NTRK融合陽性患者具有更強的侵襲轉移能力,大多數融合陽性患者出現頸部側區淋巴結多發轉移和甲狀腺被膜外浸潤,部分研究還報道遠處器官轉移[14,16-17]。

本組9例NTRK1/3融合陽性的PTC主要以濾泡狀為主,可伴有乳頭狀、柱狀或實性/小梁/島狀生長方式,與文獻報道一致[12,14,17-21]。近年來超聲引導下細針穿刺應用越來越廣泛,甲狀腺細針穿刺細胞學診斷成為甲狀腺結節手術治療的重要分流技術。為鑒別濾泡癌、濾泡性腺瘤及結節性甲狀腺腫伴腺瘤樣增生,本實驗進一步分析NTRK1/3融合陽性標本的液基細胞學特征:小片狀或小濾泡排列的細胞團,細胞擁擠重疊,缺乏微濾泡結構;細胞核可呈圓形、橢圓形或短梭形,核膜稍不規則,表面可見凹痕。與經典型PTC相比,無明顯的皺縮或“桑葚樣改變”。因部分腫瘤細胞形態較溫和,極大增加了細胞學診斷難度。NTRK1/3融合陽性標本中的腫瘤細胞常伴有胞質透明化改變,其中1例伴有明顯的透明細胞型改變,Lee等[20]的報道中也提及胞質改變。本組例9細胞學診斷為意義未明(TBS-Ⅲ級),組織學病理首次診斷為濾泡性腫瘤,未除外癌變可能,隨后結合基因檢測結果,最后診斷為PTC。因甲狀腺診斷性分子標志物BRAF V600E通常陰性,對于形態特征類似NTRK融合的病例,建議行NTRK1/3基因融合檢測。

本實驗為回顧性研究,存在一些局限性。一方面NTRK融合陽性病例數較少,無法進行統計學分析。另一方面早期患者均未使用NTRK抑制劑,因此無法統計各融合亞型對靶向藥物治療的療效差異。后續我們將繼續收集NTRK融合陽性病例,并進一步深入分析。

綜上,在散發性PTC中,NTRK基因融合陽性率較低,常見亞型為NTRK1/3。對于BRAF V600E陰性甲狀腺癌患者,當其細胞學與生物學行為反差較大時,強烈推薦行NGS檢測,以明確發病機制,篩選出轉移和預后較差的患者,以便早期干預,延長患者生存期。