甲狀腺乳頭狀癌中SMOC2的表達與臨床病理意義

凡龍云,彭 薇,王美玲,趙雅麗,肖 寒,王萬祥,吳 強,,王 弦,

甲狀腺癌是甲狀腺最常見的原發性惡性腫瘤,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinomas, PTC)是原發性甲狀腺癌中最常見的類型[1]。雖然PTC預后良好,但仍有20%～30%的PTC患者出現復發,約7%患者死亡[2]。有時甲狀腺乳頭狀增生(papillary thyroid hyperplasia, PTH)會表現出與PTC類似的組織學特征,包括發育良好的具有纖維血管軸心的乳頭狀結構、核擁擠和核分裂象,給PTC的診斷和鑒別診斷帶來困難[3]。既往研究和臨床診斷實踐發現,PTC診斷常用的免疫組化標志物對PTC的診斷準確性尚未達成統一的共識[4]。因此,有必要探索新的免疫組化標志物或組合以提高PTC的診斷準確率。

酸性富含半胱氨酸的分泌蛋白相關的模塊化鈣結合蛋白-2(secreted modular calcium binding protein-2, SMOC2)屬于SPARC家族,在人體多種實體腫瘤中的作用尚有分歧[5]。本研究在生物信息學的基礎上,采用免疫組化法檢測SMOC2在PTC組織中的表達情況,分析其與PTC臨床病理特征的關系及與CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯合輔助診斷的價值。

1 材料與方法

1.1 材料選取2021年10月～2022年7月安徽醫科大學第一附屬醫院和安徽醫科大學第二附屬醫院病理科具有完整臨床病理資料的75例PTC和45例PTH手術切除石蠟標本。排除手術前接受過化療、放療或免疫抑制劑治療以及合并其他惡性腫瘤的患者。所有病例均經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,4 μm厚連續切片,分別行HE和免疫組化染色。75例PTC中女性50例,男性25例,年齡19～74歲,中位年齡40歲。39例有局部淋巴結轉移,36例無淋巴結轉移。AJCC第八版甲狀腺腫瘤TNM分期:Ⅰ期28例,Ⅱ期44例,Ⅲ期3例。

1.2 試劑SMOC2兔多克隆抗體(GTX85703)購自GeneTex公司;CK19鼠單克隆抗體(UMAB2,即用型)、Galectin-3鼠單克隆抗體(UMAB157,即用型)、MC鼠單克隆抗體(HBME-1,即用型)、DAB顯色試劑盒(PV-6000D)均購于北京中杉金橋公司;BRAF V600E(VE1)抗體、OptiView DAB二抗試劑盒及OptiView AMP擴增試劑盒均購于羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學分析 從基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus, GEO)中選取數據集GSE3678(包括7例PTC和7例良性甲狀腺組織)和GSE33630(包括49例PTC和46例良性甲狀腺組織),分析SMOC2 mRNA在PTC和良性甲狀腺組織中的表達量差異;從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫中提取505例甲狀腺癌組織和59例良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達量,分析SMOC2 mRNA在兩者中表達量差異。

1.3.2免疫組化 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC采用免疫組化EnVision兩步法染色,主要步驟:切片脫蠟水化,檸檬酸鈉溶液熱修復,過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min,滴加一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育20 min,DAB顯色,蘇木精復染,脫水、透明后光鏡下觀察。BRAF V600E通過BenchMark Ultra全自動免疫組化儀器進行染色,主要步驟:切片75 ℃預熱4 min脫蠟水化,Ultra CC1堿性修復液100 ℃修復72 min,過氧化物酶抑制劑OV PEROX IHBTR孵育4 min,BRAF V600E一抗37 ℃孵育32 min;OV HQ UNIV LINKR孵育8 min;OV HRP MULTIMER孵育8 min;OV AMP H2O2和OV AMPLIFIER共同孵育4 min;OV AMP MULTIMER孵育4 min;OV H2O2和OV DAB共同孵育8 min;OV COPPER 孵育4 min;蘇木精復染12 min,返藍液孵育4 min,脫水、透明后光鏡下觀察。

1.4 結果判讀SMOC2以上皮細胞胞質中出現黃色或褐色顆粒為陽性染色,CK19以上皮細胞胞質中出現黃色或褐色顆粒為陽性染色,Galectin-3以上皮細胞胞質和胞核中出現黃色或褐色顆粒為陽性染色,MC以上皮細胞腔緣頂端細胞膜出現黃色或褐色顆粒為陽性染色[6]。BRAF V600E以上皮細胞胞質中出現黃色或褐色顆粒為陽性染色[7]。SMOC2評分標準:按染色強度評分:陰性為0分,弱陽性為1分,中等強度陽性為2分,強陽性為3分。評分≥1分判為陽性[8]。CK19、Galectin-3、MC著色細胞占比>10%定義為陽性。BRAF V600E在細胞質中著色即為陽性,無著色為陰性。

1.5 統計學分析應用GraphPad Prism 6.0.1和SPSS 26.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析組間蛋白表達差異及與臨床病理特征的關系,采用傳統診斷試驗公式計算敏感度、特異性和診斷準確性,受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析診斷預測價值,采用Spearman等級相關檢驗分析相關性,結果均以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析SMOC2在PTC和良性甲狀腺組織中的mRNA表達差異及診斷價值提取GEO數據庫GSE3678和GSE33630兩個數據集及TCGA數據庫中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織SMOC2 mRNA的表達量,對兩者表達量進行差異性分析及ROC曲線分析,結果顯示:SMOC2 mRNA在PTC中的表達量顯著低于良性甲狀腺組織(P<0.05,圖1A～C),ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.910(P<0.001,圖1D)。

圖1 A.GEO數據庫GSE3678數據集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;B.GSE33630數據集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;C.TCGA數據庫中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;D.GEO數據庫預測SMOC2對甲狀腺乳頭狀癌診斷價值的ROC曲線

2.2 PTC和PTH中SMOC2蛋白表達及與臨床病理特征的關系在PTH中,SMOC2蛋白表達于乳頭狀增生的上皮細胞中,定位于靠近腔緣頂端的細胞質,具有極性,呈非連續的線狀顆粒性,陽性率為91.1%(41/45);在PTC中,SMOC2在癌組織中呈陰性或弱陽性彌漫分布,陽性染色滿布于癌細胞胞質,陽性率為10.7%(8/75),明顯低于PTH(P<0.001,圖2)。SMOC2表達與淋巴結轉移呈負相關(P<0.05),與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤、TNM分期無相關性(P>0.05),且與BRAF V600E表達無相關性(rs=0.142,P>0.05,表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中SMOC2表達與臨床病理特征的關系

2.3 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E對PTC的診斷價值及比較SMOC2對PTC診斷的敏感度為91.1%,特異性為89.3%,診斷準確性為90.0%,陽性似然比(positive likelihood ratio, PLR)為8.514,陰性似然比(negative likelihood ratio, NLR)為0.099。ROC曲線分析結果顯示AUC值為0.898(P<0.001,圖3)。在PTC組織中,CK19蛋白定位于細胞質,呈彌漫分布,診斷的敏感度為100.0%,特異性為84.4%;Galectin-3蛋白定位于細胞核和細胞質,呈彌漫分布,診斷的敏感度為92.0%,特異性為80.0%;MC蛋白定位于腔緣頂端細胞膜,呈完整連續著色,診斷的敏感度為94.7%,特異性為64.4%;BRAF V600E蛋白定位于細胞質,呈彌漫分布,診斷的敏感度為94.7%,特異性為88.9%。在PTH組織中,CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E均呈陰性(表2,圖4)。單獨診斷時,CK19的敏感度最高,但其特異性差;SMOC2診斷的敏感度雖然低于CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E,但特異性最高(89.3%)。

圖3 SMOC2對甲狀腺乳頭狀癌診斷價值的ROC曲線

圖4 PTC和PTH的HE染色及CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化染色,EnVision兩步法:PTC.甲狀腺乳頭狀癌;PTH.甲狀腺乳頭狀增生

2.4 SMOC2聯合CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E在PTC和PTH鑒別診斷中的價值在鑒別PTC和PTH時,SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E的診斷價值以敏感度和特異性的形式表現。SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E相互組合進行PTC聯合輔助診斷(圖5),SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯合輔助診斷的AUC值為1.000(P<0.001),在一定程度優于其他標志物組合,當Cut-off值為0.500時,診斷的敏感度和特異性均高達100.0%。

圖5 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯合輔助診斷的ROC曲線

3 討論

SMOC2作為一種分泌型基質細胞蛋白,在許多組織中廣泛表達,參與多種細胞功能,包括細胞黏附和遷移[9]、血管生成[10]、纖維增生[11]和細胞增殖[12]等,在多種實體腫瘤中起促癌或抑癌基因的作用。既往研究顯示,其生物學功能主要多與促癌特性有關,但在結直腸癌、胰腺癌、膽囊癌和晚期乳腺癌中起抑癌基因的作用[13],而在PTC中SMOC2蛋白表達情況及作用機制尚不明確。

本研究采用生物信息技術學在數據庫中提取SMOC2 mRNA的表達量,分析其在PTC和良性甲狀腺組織中的差異量表達,并在生信分析基礎上對PTC和PTH石蠟切片進行SMOC2免疫組化檢測。生物信息技術學結果顯示SMOC2在PTC中的表達較良性甲狀腺組織顯著降低;免疫組化結果顯示SMOC2在PTC組織中呈陰性或弱陽性彌漫著色,在PTH組織增生的乳頭狀結構中可見明顯的陽性染色,呈線狀顆粒性表達,其分布具有極性。可見,SMOC2在PTC組織中的陽性率降低和在細胞質中表達的極性消失可在一定程度上提示其惡性特征,對PTC診斷和鑒別診斷具有重要的輔助作用。

Jang等[14]的研究顯示,SMOC2在正常結腸黏膜基底隱窩中呈陽性,在結腸癌組織中呈陰性或弱陽性彌漫表達,定位于細胞質,陽性率明顯下降,在淋巴結轉移病例中SMOC2表達進一步下降,且與淋巴結轉移呈負相關。本組SMOC2在PTC中的表達情況在一定程度上與SMOC2在結腸癌中的表達及與臨床病理特征的關系一致,但其是否在PTC中發揮抑癌基因的作用有待進一步研究。

分析SMOC2與PTC臨床病理特征關系發現,SOMC2表達與淋巴結轉移呈負相關,與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤、TNM分期無相關性。既往研究[8]顯示,在38%的PTC中觀察到SMOC2完全缺失與BRAF突變缺失相關,本組PTC中SMOC2表達與BRAF V600E突變相關性分析并未發現兩者間的相關性,有待擴大樣本進一步觀察。本組67例SMOC2表達丟失病例中,38例有淋巴結轉移,29例無淋巴結轉移,提示SMOC2丟失可能與PTC發生淋巴結轉移相關。

根據Xin等[15]提出的標準,分子標志物的PLR>10或NLR<0.1可視為獨立診斷指標,SMOC2的NLR<0.1,由此提示SMOC2可作為單獨診斷PTC的標志物,但其缺乏較高敏感度和特異性,需與其他標志物聯合檢測。本實驗CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化結果與Asghari等[16]和Parker等[17]的研究結果一致。以上標志物相互組合,以SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯合輔助診斷PTC時,其AUC值最高,輔助診斷效能優于其余標志物組合,成為新的高敏感度和特異性的組合。

綜上所述,SMOC2陽性率下降和在細胞質中表達的極性消失可作為PTC診斷和鑒別診斷的重要標志物,與CK19、Galectin-3、MC、BRAF V600E五者聯合檢測優于其他標志物組合,可在一定程度上提高對PTC診斷的敏感度和特異性。