術前活檢標本中腫瘤出芽與結直腸癌臨床病理學特征及預后的相關性

楊路路,周文斌,王勁松,黃文斌,方 媛

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是消化系統常見的惡性腫瘤之一,其發病與遺傳、飲食和生活習慣等因素有關,隨著人們生活水平的提高,我國CRC的發病率呈逐年上升趨勢,轉移和復發是患者死亡的主要原因[1]。內鏡下活檢組織病理檢查是早期篩查和診斷CRC的“金標準”,活檢病理診斷的精準評估對患者癌癥風險預判和個體化治療具有重要意義?；顧z標本是從腫瘤淺表區域獲取的小塊組織,用傳統的組織學參數(如浸潤深度、脈管神經累犯等)評估腫瘤生物學行為存在較大的局限性,多數活檢標本只能評估腫瘤的分化程度。腫瘤出芽是指從腫瘤主體分離出來的單個癌細胞或﹤5個癌細胞簇的組織學形態,腫瘤出芽可能是腫瘤組織侵襲、轉移的始發階段[2-3]。根據出芽部位可分為腫瘤浸潤前沿出芽(peritumoural budding, PTB)和腫瘤內出芽(intratumoural budding, ITB)[4-5]。手術切除標本中PTB與CRC侵襲性生物學行為密切相關已被較多研究證實,但目前ITB的臨床病理學意義尚不清楚[6-8]。CRC活檢標本中的腫瘤出芽由于位于腫瘤內應為ITB,其能否作為術前評估CRC風險分層的臨床病理學參數,以及與PTB之間的關系目前國外文獻報道甚少,國內尚無相關報道。由于炎癥和促纖維間質反應等有時會干擾腫瘤出芽的判斷,本實驗采用CKpan標記腫瘤細胞,觀察144例CRC活檢標本和對應手術切除標本中腫瘤出芽形成情況,探討活檢組織中腫瘤出芽與CRC臨床病理學參數及預后的關系,為CRC的術前診治和預后評估提供更可靠的指標。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2017年12月南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院)病理科經術前活檢及對應根治性手術切除標本診斷為結直腸腺癌144例;其中男性94例,女性50例;年齡27～89歲,平均66歲;腫瘤最大徑1～12 cm,平均4.7 cm。所有患者術前均未行放、化療和免疫治療。

1.2 方法由兩名高年資病理醫師采用雙盲法瀏覽每例活檢和根治性手術切除標本的所有HE及免疫組化染色切片,評估腫瘤出芽及相關臨床病理學參數,活檢標本參數:ITB、分化程度;手術切除標本參數:PTB、分化程度、浸潤深度、脈管浸潤(血管或淋巴管)、神經累犯、淋巴結轉移、pTNM分期。當評估意見不一致時,在多頭顯微鏡下同時觀察分析并達到統一。所有標本均經10%中性福爾馬林固定,常規脫水、石蠟包埋,分別行HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法,所用一抗CKpan及二抗均購自北京中杉金橋公司,所有操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 腫瘤出芽評估活檢標本中腫瘤出芽的判讀參照Rogers等[9]的標準,即腫瘤間質中單個癌細胞或﹤5個癌細胞組成的細胞簇,光鏡下(200×,視野面積0.785 mm2)觀察有無腫瘤出芽,同時采用CKpan標記腫瘤細胞,對出芽的腫瘤細胞進行確認;手術切除標本中PTB判讀方法同上。

1.4 隨訪隨訪資料通過電子病歷及電話隨訪獲取,隨訪時間為2016年1月～2021年8月?？偵嫫?overall survival, OS)為患者接受手術之日至隨訪截止時間或死亡的時間,無進展生存期(progression-free survival, PFS)為患者從手術之日到癌癥發生進展(腫瘤復發、轉移)或死亡的時間。

1.5 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析,腫瘤出芽與CRC臨床病理學特征的關系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法;活檢標本中ITB與手術切除標本中PTB的相關性采用Spearman分析;生存分析采用Kaplan-Meier函數,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC中腫瘤出芽組織學特征活檢組織腫瘤內及手術切除標本腫瘤浸潤前沿纖維性間質內可見單個或小灶性腫瘤細胞從腫瘤性腺體分離;出芽的腫瘤細胞異型性大,呈多角形或梭形,胞質較豐富、嗜酸性,常發生融合,核深染;免疫組化標記CKpan,可以清楚地觀察到出芽的腫瘤細胞(圖1～6)。

2.2 活檢組織中ITB與CRC臨床病理學特征的關系144例CRC活檢標本中,ITB 57例,ITB檢出率為39.6%,活檢組織中ITB與淋巴結轉移、pTNM分期、分化程度、脈管浸潤及神經累犯密切相關(P<0.05),ITB與患者年齡、性別、腫瘤大小和浸潤深度無關(P>0.05,表1)。

2.3 手術切除標本中PTB與CRC臨床病理學特征的關系144例CRC手術切除標本中,PTB 93例,PTB檢出率為64.6%,手術切除標本中PTB與淋巴結轉移、pTNM分期、分化程度、脈管浸潤及神經累犯密切相關(P<0.05),PTB與患者年齡、性別、腫瘤大小和浸潤深度無關(P>0.05,表1)。

2.4 CRC活檢標本與手術切除標本腫瘤出芽的相關性相關性分析顯示:活檢組織中ITB與手術切除標本中PTB的檢出呈正相關(r=0.510,P<0.05,表2)。

2.5 生存分析134例患者獲得隨訪資料,隨訪時間1～68個月(中位隨訪時間50個月),死亡39例,生存95例,總生存率為70.90%,無進展生存率為67.16%,其中4例患者發生肺轉移、9例肝轉移、1例卵巢轉移、4例復發。生存分析顯示,活檢標本中腫瘤出芽組患者平均OS為(40.86±18.45)個月,低于無腫瘤出芽組[(49.93±14.26)個月],且腫瘤出芽組平均PFS為(36.45±12.16)個月,低于無腫瘤出芽組[(48.53±16.06)個月],兩者差異均具有統計學意義(POS=0.001、PPFS<0.001),活檢組織中ITB與CRC患者的OS和PFS顯著相關,患者預后更差(圖7、8)。

圖7 活檢組織中腫瘤內出芽與患者總生存率的關系

圖8 活檢組織中腫瘤內出芽與患者無進展生存率的關系

3 討論

腫瘤出芽是一種腫瘤生物學行為,是腫瘤侵襲活動的重要標志,近年來受到越來越多學者的重視[10-13]。腫瘤出芽定義為腫瘤內或浸潤前沿間質中呈未分化的單個癌細胞或<5個癌細胞的細胞簇,可分為PTB和ITB。PTB是指腫瘤與正常組織交界處的出芽,在內窺鏡、手術切除標本中評估,ITB是指腫瘤主體內的出芽,在手術、活檢標本中均可評估[4]。目前研究認為腫瘤出芽模擬腫瘤上皮-間質轉化(epithelial-mesenchiymal, EMT)過程獲得侵襲轉移能力[3]。Brabletz等[14]研究發現,CRC中出芽腫瘤細胞E-cadherin表達下調,同時伴有β-catenin核移位、細胞極性喪失和成纖維母細胞形態的形成;腫瘤出芽還可表達干細胞標志物,如EpCAM和CD44s等[15];因此,腫瘤出芽可能是腫瘤生長或轉移的始發階段,與腫瘤進展密切相關。

國際抗癌聯盟(UICC)已正式明確PTB是CRC侵襲性行為與不良預后的一個重要指征[4]。Rogers等[16]Meta分析結果顯示,腫瘤出芽是CRC淋巴結轉移、癌癥復發和5年生存率的不良預后因子。李正勇等[17]研究34例T1N0M0期患者,發現腫瘤出芽是提示CRC經內鏡切除治療后早期復發及轉移的危險因素。Ueno等[7]進行了一項多中心研究,結果發現腫瘤出芽分級與腫瘤T分期、脈管浸潤、神經累犯及CEA指標等密切相關,出芽級別與肝、肺、淋巴結和腹膜轉移顯著相關,多因素分析顯示,腫瘤出芽是CRC患者RFS獨立的預后因子,還可以預測Ⅱ期CRC患者新輔助化療的治療效果。本組前期研究結果也進一步證明PTB與CRC不良病理參數顯著相關[18]。

目前CRC活檢標本中腫瘤出芽的研究不如手術切除標本研究深入,尚無統一的評估標準。國際腫瘤出芽發展共識(ITBCC)采用熱點區計數腫瘤出芽數量進行分級(0～4個為低級別,5～9個為中級別,≥10個為高級別),該方法比較適合手術切除標本中腫瘤出芽的評估;Yamadera等[19]提出2級分級系統,分為“低級別(0～9個)”和“高級別(≥10個)”;Rogers等[9]將活檢標本中腫瘤出芽簡單地分為“陰性”和“陽性”。由于活檢標本組織小,通常不需要多個高倍視野評估,腫瘤出芽較手術切除標本少,本實驗采用有、無腫瘤出芽進行分組,該方法在活檢標本中評估腫瘤出芽具有較好的實用性。本實驗主要探討活檢組織中腫瘤出芽的臨床意義,對于其評估的最佳方法有待進一步研究。盡管腫瘤出芽在HE染色下即可觀察,但有時因炎癥及促纖維間質反應等干擾腫瘤出芽的識別,因此在形態學難以辨認的病例中行CKpan免疫組化染色可以清楚地顯示出芽的腫瘤細胞,從而減少對腫瘤出芽的誤判或漏判。

本組活檢標本中ITB與CRC淋巴結轉移、病理分期、分化程度、脈管浸潤和神經累犯等密切相關,活檢組織中檢出腫瘤出芽者更易發生脈管內癌栓、神經累犯及淋巴結轉移,腫瘤分級、分期也更高;且發現活檢標本中ITB與對應手術切除標本中PTB之間存在較強的正相關性,與Zlobec等[20]研究結果一致。Zengin等[21]對82例接受術前活檢及手術切除的早期直腸癌(pN0)中腫瘤出芽進行研究,發現高級別腫瘤出芽與淋巴管內癌栓、神經累犯、高級別pT分期、侵襲性浸潤方式及周緣陽性等顯著相關,是判斷早期CRC淋巴結及遠處轉移的危險因素。Giger等[22]研究也顯示活檢標本中高級別腫瘤出芽對CRC淋巴結受累及遠處轉移具有較高的靈敏度及陽性預測值。本實驗生存分析亦顯示,活檢標本中腫瘤出芽患者的OS低于無腫瘤出芽者,且PFS較無腫瘤出芽患者明顯縮短,腫瘤出芽患者更易發生局部復發和遠處轉移。上述研究結果高度提示活檢組織中腫瘤出芽現象在一定程度上反映了腫瘤主體的生物學行為,與腫瘤的侵襲性和不良轉歸密切相關。

國外有研究發現[9],活檢組織中腫瘤出芽是CRC新輔助放、化療不良腫瘤退縮及患者不良預后的標志,有可能成為患者避免新輔助放、化療的一個指標。Hatthakarnkul等[23]Meta分析顯示,高級別腫瘤出芽與KRAS突變和MSS/pMMR狀態顯著相關,這表明KRAS突變和MSS狀態在腫瘤出芽及腫瘤發展中發揮著重要作用。結合文獻和本實驗結果表明,在CRC活檢標本中評估腫瘤出芽有助于預測CRC的生物學行為,從而指導臨床選擇合適的治療方案。

綜上所述,活檢標本中ITB與對應手術切除標本中PTB之間存在強相關性,ITB的檢出與腫瘤主體不良病理學特征密切相關,活檢組織中出現腫瘤出芽有望成為CRC術前管理的生物學標志物,有助于CRC患者的個體化治療及預后評估。