冬季衡水湖沉積物微生物群落結構特征及影響因素

曹洋，孫鶴銘，劉利*，敖蒙蒙，王儉，魏健

1.遼寧大學環境學院

2.中國環境科學研究院水生態環境研究所

沉積物是湖泊水體內部主要的污染物來源和微生物聚集地[1]，尤其是處于次好氧-厭氧狀態的表層沉積物是多種營養物質轉化的重要場所[2]，是參與湖泊水體物質循環的重要一環。已有研究表明，微生物群落特征的變化會影響沉積物中氮、磷營養物的化學循環及微生物的降解功能[3]，由微生物介導的有機物降解和轉化是湖泊污染物周轉過程的重要環節[4-5]。同時，微生物的群落結構也會受到營養鹽濃度水平、水期變化、植物種類等多種環境因素影響[6-8]。湖泊不同湖區往往生境特征不同，對沉積物中微生物菌屬和群落結構產生不同影響，從而影響沉積物中有機物和營養物的化學循環過程，進而對水體水質產生影響。因此，開展水體沉積物中微生物群落分布特征及其與環境因子相關性的研究，對針對性開展湖泊污染治理和生態修復具有重要意義。

衡水湖是華北平原上第一個國家級濕地自然保護區，其生態系統的健康穩定對維持周邊乃至京津地區氣候環境穩定性具有重要意義[9-10]。近年來，衡水湖外源污染（工業廢水、農村生活污水和畜禽養殖等）已得到有效控制，然而衡水湖水體富營養化趨勢仍不容樂觀，內源污染已成為衡水湖治理與保護亟待解決的主要問題。目前，針對衡水湖內源污染的研究主要集中在營養鹽形態分布、持久性有機物污染特征及重金屬污染特征等方面[10-11]，而針對沉積物中微生物群落結構特征的研究尚未開展，尤其是冬季低溫環境下沉積物微生物群落空間分布特征及其與環境因子響應關系的研究仍為空白。

筆者以冬季衡水湖不同湖區表層沉積物為研究對象，采用高通量測序技術對沉積物中微生物群落結構進行分析，探討衡水湖生境特征差異引起的微生物群落結構特征及其多樣性的變化，分析沉積物中微生物群落結構、多樣性及其環境因子之間的響應關系，以期為衡水湖的治理與保護提供理論支持，同時也為類似湖泊的水環境保護提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況及樣品采集

衡水湖（115°27′50″E～115°42′51″E，37°31′40″N～37°41′56″N）湖泊面積為 75 km2，東西長 22.28 km，南北長18.81 km，平均水深為3～4 m。所在區域屬于暖溫帶大陸季風氣候區，年平均氣溫為13 ℃，年降水量為518.9 mm[9-10]。

衡水湖湖北區種植有大量的蘆葦、蓮和紫萍等水生植物，植被覆蓋度約為60%；湖心區歷史上曾設立過漁場，目前水生植物生物量較少，植被覆蓋度約為30%；湖南區歷史上實施過挖掘工程，目前植被覆蓋度約為15%。充分考慮衡水湖生境特征和周邊環境因素，在湖區布設8個采樣點，其中湖北區3個（S1～S3），湖心區 3 個（S4、S5、S8），湖南區 2 個（S6、S7）。采樣點位置及信息見圖1。

圖1 沉積物采樣點分布示意Fig.1 Map of sediments sampling sites

冬季湖泊水體和沉積物中污染物受外部因素影響較小，能較準確反映湖泊內源污染的真實狀況[12]。于2020年12月在8個采樣點采集表層沉積物(0～10 cm)樣品及上覆水水樣。上覆水水樣盡快運回實驗室測定化學需氧量（COD）、總氮（TN）、總磷（TP）、氨氮（NH3-N）等指標。沉積物樣品采集后放入聚乙烯自封袋并盡快運回實驗室，低溫儲存，冷凍干燥處理后用于測定TN、TP、有機碳（TOC）濃度及pH。另取一部分新鮮沉積物樣品用于測定氨態氮（NH4+-N）、硝態氮（NO3--N）、亞硝態氮（NO2--N）濃度。

1.2 水樣與沉積物樣品指標測定

根據《水和廢水監測分析方法》4版[13]測定上覆水COD與NH3-N、TN、TP濃度。沉積物樣品剔除沙石、動植物碎片等，使用冷凍干燥機預處理后進行研磨，過100目尼龍篩后裝入聚乙烯塑料自封袋，放入冰箱，備用。采用燒失量法[9]測定沉積物中TOC濃度；運用連續提取法(SMT法)提取沉積物樣品中TP，采用鉬銻抗分光光度法測定沉積物中TP濃度；采用過硫酸鹽氧化法[10]測定沉積物中TN濃度，采用氯化鉀溶液提取-分光光度法測定沉積物中NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度。酸堿度采用pH計測定。

1.3 微生物高通量測序

用于微生物分析的樣品送到上海美吉生物科技股份有限公司進行微生物組總DNA提取，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對提取的DNA進行PCR擴增，引物信息見表1。PCR采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反 應 體系，PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。全部樣本按照正式試驗條件進行PCR擴增，每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

表1 PCR擴增引物信息Table 1 PCR amplification primer information

1.4 數據分析

使用QIIME軟件過濾、拼接和去除嵌合體，將運算分類單位（operational taxonomic units，OTU）在97%的相似水平劃分，對OTU代表序列通過比對16S bacteria數據庫進行分類學分析，根據最小樣品的序列數抽平后，運用QIIME程序計算α多樣性指數。其中，Shannon、Simpson指數用于評估物種多樣性，Chao指數用來表征物種豐富度[12]，Coverage指數、Heip指數分別用來表征菌群覆蓋率及均勻度[14-16]。利用R語言工具作圖，得出不同分類水平下微生物群落結構柱形圖。基于97%相似性的樣本OTU數據和環境因子數據，運用R語言vegan包進行RDA（redundancy analysis）分析得出冗余分析圖。使用R語言vegan包繪制樣本間距離熱圖，通過計算環境因子與所選菌屬之間的Spearman相關性系數，并基于R語言的pheatmap包繪制相關性熱圖。

2 結果與討論

2.1 衡水湖上覆水及沉積物理化性質

冬季衡水湖表層沉積物理化指標如表2所示。由表2可知，衡水湖表層沉積物中TN平均濃度為1.987 mg/g，屬中度污染水平；TP平均濃度為1.411 mg/g，屬重度污染[17]；TOC平均濃度為50.941 mg/g，屬有機污染水平[10,17]。整體而言，湖泊沉積物有機污染和磷污染問題較為嚴重，存在極大的磷釋放風險，沉積物中高有機質濃度對氮鹽的釋放也有一定促進作用。沉積物中TN、TP和TOC平均濃度均表現為湖心區＞湖南區＞湖北區，表明湖心區沉積物營養鹽污染狀況最嚴重，這可能與湖心區有過水產養殖有關。各采樣點表層沉積物中NH4+-N濃度為0.123～0.472 mg/g，NO3--N濃度為 0.011～0.164 mg/g，NO2--N濃度較低，均值為6.17 × 10-4mg/g。結果表明，沉積物中氮鹽存在形式以NH4+-N為主，其中S8點位TN、TP、TOC、NH4+-N和NO3--N濃度較高，這與張嘉雯等[10]對衡水湖沉積物營養鹽形態分布的研究結果一致。

表2 衡水湖冬季不同湖區表層沉積物理化指標統計Table 2 Statistics of physicochemical indexes of surface sediments in different areas of Hengshui Lake in winter

由衡水湖不同湖區采樣點上覆水營養鹽濃度（圖2）可知，湖北區采樣點上覆水TN濃度顯著高于其余湖區采樣點，而其沉積物中TN濃度低于其余湖區采樣點。該現象與在白洋淀[7]的研究結果相似，可能是由于冬季湖北區大量衰亡的水生植物腐解，造成的厭氧環境加劇了沉積物中弱結合態氮的釋放，從而導致上覆水TN濃度與其他湖區相比較高。湖心區上覆水及沉積物中TP和NH4+-N濃度均較高，這可能是由于湖心區歷史上漁業養殖導致營養鹽積累較多，內源負荷較高致使污染物二次釋放到上覆水體中。

圖2 衡水湖不同湖區采樣點上覆水及沉積物中營養鹽濃度Fig.2 Nutrient concentrations of overlying water and sediments at different sampling points in Hengshui Lake

2.2 沉積物微生物群落多樣性分析

2.2.1 微生物α多樣性分析

通過高通量測序，在97%的相似性度下將其聚類為用于物種分類的OTU，8個表層沉積物樣品共得到 5 043個OTUs，分屬61門、178綱、384目、556科、827屬和1 668種。

計算不同采樣點沉積物中微生物群落的α多樣性指數，結果如圖3所示。Shannon指數與物種多樣性成正比，Simpson指數則與物種多樣性成反比。由圖3可知，各湖區Shannon指數平均值排序為湖北區（6.50）＞湖心區（6.20）＞湖南區（5.90），Simpson 指數平均值排序為湖南區（0.016）＞湖心區（0.009）＞湖北區（0.007）。湖北區、湖心區Shannon指數和Simpson指數存在極顯著差異（P＜0.01）。各湖區沉積物的Heip指數平均值排序為湖北區（0.21）＞湖心區（0.18）＞湖南區（0.14）。Chao 指數平均值排序為湖北區（3 961）＞湖心區（3 662）＞湖南區（3 561），衡水湖各采樣點沉積物Chao指數均高于白洋淀沉積物(1 354.96±645.82)[18]、華南地區的紅樹林沉積物(2 243±96)[19]。以上結果說明衡水湖表層沉積物中微生物群落多樣性及豐富度較高。另外，各湖區Coverage指數均達到97%以上，表明衡水湖表層沉積物物種覆蓋率較高。

圖3 不同湖區各采樣點沉積物中微生物群落α多樣性指數Fig.3 Alpha diversity indexes of microbial communities of sediments at each sampling site in different lake areas

綜上，衡水湖表層沉積物中微生物群落多樣性較高，水體環境適宜微生物生存繁殖。水體沉積物中微生物群落多樣性的結果為湖北區＞湖心區＞湖南區，湖北區與湖心區沉積物的微生物群落結構存在極顯著差異。有研究表明，沉積物中細菌群落多樣性隨營養鹽水平升高而下降，衡水湖湖北區水生植物覆蓋度最高，水體自凈能力也高，營養鹽污染狀況相對湖心區和湖南區較輕[7]。

2.2.2 微生物β多樣性分析

在群落生態學中，β多樣性指數聚焦于不同生境間多樣性的比較[20]，可反映不同湖區間沉積物樣品微生物群落結構的差異。以OTU水平做出樣本相關距離熱圖，距離系數越大顏色越深，則表明2個采樣點間存在的物種差異性越大。由不同采樣點樣本相關距離熱圖（圖4）可以看出，各湖區顏色分化較明顯，說明衡水湖各湖區沉積物中微生物群落結構存在較明顯的差異。同處湖北區的S1和S2采樣點距離系數最小，為0.207，說明大趙閘和南李莊村的微生物群落具有較高的相似度；S1和S8的距離系數最大，為0.455，說明大趙閘和小湖心的微生物群落差異性較大。研究表明，微生物群落結構特征的差異是微生物與水體環境長期相互響應的結果，在富營養化和接近富營養化的湖區水體中微生物群落多樣性隨著營養鹽水平的升高而降低[21]，湖心區采樣點沉積物中TN、TP、TOC、NH4+-N及NO3--N濃度遠高于湖北區采樣點，因此沉積物營養鹽污染水平對微生物群落結構差異造成一定影響。除此之外，湖心區植物覆蓋度低于湖北區，營養物質更多來源于歷史的餌料投喂。因此，湖北區與湖心區沉積物的微生物群落結構差異明顯，與不同區域環境、營養鹽濃度及有機物組分差異有關。

圖4 不同采樣點樣本相關距離熱圖Fig.4 Heatmaps of sample correlation distances at different sampling points

2.3 沉積物中微生物群落結構組成

2.3.1 門水平微生物群落結構

在門水平上，將相對豐度≥1%的微生物繪制成柱形圖，結果如圖5所示。由圖5可知，沉積物中微生物群落在門水平上較為豐富，相對豐度較高的優勢細菌門依次是變形菌門（Proteobacteria，28.8%～39.4%）、綠彎菌門（Chloroflexi，11.4%～23.5%）、脫硫菌門（Desulfobacterota，8.0%～12.2%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，5.0%～7.8%）、酸桿菌門（Acidobacteria，4.2%～8.9%）、放線菌門（Actinobacteria，4.3%～6.6%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，1.1%～2.9%），這7類優勢類群在沉積物中的相對豐度均為60%以上。在很多湖泊沉積物的研究中，亦發現Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和 Bacteroidetes為優勢菌種類[22-23]。衡水湖與其他研究區域[24-27]水體沉積物微生物群落結構組成相似，但與其他研究區域水體沉積物的優勢細菌門存在差異。湖泊表層沉積物中常見優勢菌門有 Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Nitrospirae 和厚壁菌門（Firmicutes），除Firmicutes外，其他5個常見優勢菌門均是衡水湖沉積物中的優勢菌門。有研究發現，Firmicutes在黃河、鄱陽湖、太湖等水體沉積物微生物群落中均為優勢菌門，但在我國遼河四平段流域、雙臺子河、遼河入海口等北部河流沉積物微生物群落中相對豐度較低[20]，這與衡水湖表層沉積物中Firmicutes相對豐度也較低的研究結果相一致。

圖5 不同湖區采樣點沉積物門水平微生物群落結構Fig.5 Microbial community structure at phylum levels of sampling sites in different lake areas

微生物相對豐度在湖北區和湖心區存在顯著性差異（P＜0.05）的細菌門為 Chloroflexi、Desulfobacterota、Actinobacteria、Acidobacteria 和Nitrospirae， 這 些細菌門中相對豐度排序為湖北區＞湖心區的是Desulfobacterota、Acidobacteria 和Nitrospirae，說明這些細菌門更適宜在水生植物豐富的環境下生長。相對豐度排序為湖心區＞湖北區的細菌門是Chloroflexi和Actinobacteria，其中湖心區沉積物樣品中Chloroflexi的相對豐度顯著高于其他湖區。Chloroflexi為光能自養菌，與沉積物碳循環有關，具有發酵、固定CO2和乙酸化作用[28]，能在各種環境條件下較好生存，在有機污染物降解方面也發揮著重要作用[29]。湖心區歷史上為養殖漁場，沉積物中有機質濃度明顯高于其他湖區，可為Chloroflexi的生長繁殖提供有利條件。

湖南區和湖心區存在顯著性差異（P＜0.05）的細菌門有 Chloroflexi、Desulfobacterota、Nitrospirae和Patescibacteria。其中，相對豐度排序為湖南區＞湖心區的是Desulfobacterota和Nitrospirae，說明這2個細菌門對營養鹽濃度較敏感，更適宜在富營養化程度小的環境下生存；相對豐度排序為湖心區＞湖南區的細菌門是Chloroflexi和Patescibacteria，說明這2個細菌門適宜在營養鹽豐富的環境下生存，其生長繁殖與湖心區沉積物營養鹽污染嚴重有關。

2.3.2 屬水平微生物群落結構

不同湖區采樣點沉積物屬水平微生物群落結構如圖6所示。由圖6可知，在屬水平上，衡水湖各采樣點物種相對豐度小于1%的菌屬占比較大，這類菌屬總豐度在36%以上，說明衡水湖表層沉積物的微生物豐富度較高，與其α多樣性分析的結果一致。各湖區采樣點沉積物優勢分類群結構相似，不同湖區細菌群落差異主要體現在共有類群相對豐度的變化上。衡水湖表層沉積物的優勢菌屬是硫桿菌屬（Thiobacillus，相對豐度10.1%～17.9%）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）下的某屬（相對豐度2.1%～11.3%）、類固醇桿菌科（Steroidobacteraceae）下的某屬（相對豐度2.0%～6.5%）、Sva0081（相對豐度1.6%～2.5%）、P9X2b3D02（相對豐度0.9%～2.7%）和 SBR1031（相對豐度1.3%～3.0%）。

圖6 不同湖區采樣點沉積物屬水平微生物群落結構Fig.6 Microbial community structure at genus levels of sampling sites in different lake areas

湖心區沉積物中Anaerolineaceae下的某屬相對豐度是湖北區沉積物的2.27倍，是湖南區的4倍，但湖心區沉積物中P9X2b3D02的相對豐度是湖北區沉積物的0.67倍，是湖南區沉積物的0.74倍。與湖南區和湖北區沉積物相比，湖心區沉積物中相對豐度明顯增大的菌屬為Anaerolineaceae下的某屬、SBR1031和Denitratisoma等。與湖心區和湖北區沉積物相比，湖南區沉積物中相對豐度明顯增大的菌屬為Thiobacillus、Sva0081和Steroidobacteraceae下的某屬等。Thiobacillus不僅可以有效去除水體中的硝態氮[30]，還對硫的轉化和降解有著顯著作用，有助于提升水體自凈能力。Sva0081是Desulfobacteraceae下的菌屬，該科下菌屬均為硫酸鹽還原菌（sulfatereducing bacteria，SRB），SRB 為厭氧細菌，可將SO42-還原成H2S，對湖泊中硫和重金屬的化學循環有積極作用[31]。Sva0081在湖南區沉積物中的相對豐度遠高于其他湖區，這與湖南區沉積物高NH4+-N濃度有關，陰星望等[25]的研究也發現，該菌屬相對豐度與NH4+-N濃度成正比，這與本研究結果一致。

Anaerolineaceae下 的 某 屬 、P9X2b3D02和SBR1031相對豐度在湖北區和湖心區沉積物之間存在顯著性差異（P＜0.05），P9X2b3D02 相對豐度排序為湖北區＞湖心區，說明該菌屬更適宜在水生植物豐富的環境下生長繁衍。Anaerolineaceae下的某屬和SBR1031相對豐度為湖心區＞湖北區，Anaerolineaceae下的某屬是Chloroflexi下的厭氧細菌且在該門中占主導，具有發酵作用，可利用糖類和蛋白質進行代謝生長[32]，其在湖心區相對豐度最高。湖心區豐富的營養物質增強了底泥微生物的物質循環，該過程消耗大量氧氣，有利于厭氧菌的繁殖生存。

2.4 微生物群落結構與環境因子相關性

2.4.1 冗余分析

在屬水平上構建沉積物中微生物群落與沉積物理化性質的冗余分析圖，結果如圖7所示。圖7中箭頭長短代表環境因子與微生物菌屬的相關程度，箭頭越長，相關性越大，反之相關性越小[33]。由圖7可知，沉積物TOC濃度對湖心區微生物群落結構影響較大，這與湖心區沉積物有機污染嚴重的狀態相關。RDA1和RDA2共同解釋了總體變化的80.41%，其中沉積物中TN、TP、TOC、NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度與第一主軸和第二主軸呈正相關，對湖心區沉積物細菌群落影響較大；沉積物pH與第一主軸呈正相關，與第二主軸呈負相關，對湖南區沉積物的細菌群落影響較大。

圖7 不同湖區采樣點沉積物中微生物菌屬與沉積物理化指標冗余分析Fig.7 Redundancy analysis diagram of microbial genera and sediment properties of sediments at sampling sites in different lake areas

2.4.2 相關性分析

冗余分析只能從總體上反映環境因子與微生物菌屬的關系，為了明確衡水湖冬季沉積物中微生物菌屬與環境因子的相關性，將屬水平優勢菌屬（分類水平豐度前30%）與環境因子進行Spearman相關性分析，結果如圖8所示。

圖8 微生物菌屬與上覆水、沉積物理化指標相關性分析熱圖Fig.8 Heatmap of correlation analysis between microbial genera and physical-chemical indexes of overlying water and sediments

SBR1031作為綠彎菌門下的菌屬[34]，其相對豐度與氮鹽的濃度顯著相關[35]。衡水湖沉積物中豐富的NH4+-N為SBR1031提供了充足的氮源，因而沉積物中SBR1031的相對豐度與NH4+-N濃度呈顯著正相關（P≤0.05），這與高志偉等[35]的研究結果一致。Thiobacillus相對豐度與TOC濃度呈正相關，Denitratisoma相對豐度與TOC濃度呈極顯著正相關（P≤0.001），該研究結果與白洋淀沉積物的研究結果[7]一致。Thiobacillus在濕地生態系統的C、N、S等元素循環中發揮著重要作用[36]，本研究結果進一步表明了Thiobacillus與碳的利用有密切關系。Sutterellaceae下的某屬、P9X2b3D02、Aminicenantales下的某屬及螺旋體屬（Spirochaeta）等8個優勢菌屬的相對豐度與TOC濃度呈顯著負相關（P≤0.05）。綜上可知，沉積物TOC濃度對沉積物中多種菌屬產生顯著影響，這可能與衡水湖表層沉積物有機污染嚴重有關。已有研究發現，衡水湖沉積物中有機質可能主要來自陸生高等植物，蘆葦、蒲草等植物凋謝后的殘體可能是衡水湖沉積物中有機質的主要來源[10]。據此分析，衡水湖冬季沉積物碳源污染與該季節水生植物大量腐爛形成的生物沉積有關，碳源污染致使衡水湖沉積物內源污染嚴重。因此，加強植物殘體清除和底泥疏浚是控制衡水湖內源污染的重點。

有機質、總氮、總磷濃度和pH等均會對沉積物微生物群落結構產生不同程度的影響[25]，不同區域不同水體的關鍵影響因素不同。已有研究表明，pH是鄱陽湖河口微生物群落的關鍵影響因素[26]，TP是洪澤湖西北部濕地沉積物微生物群落的關鍵影響因素[36]。本研究中，沉積物TOC濃度是衡水湖水體沉積物微生物群落結構的關鍵影響因素。

3 結論

（1）衡水湖表層沉積微生物群落多樣性較高，水體環境適宜微生物生存繁殖。沉積物微生物群落多樣性的結果為湖北區＞湖心區＞湖南區，湖北區與湖心區沉積物的微生物群落結構存在極顯著差異（P＜0.01）。

（2）衡水湖各湖區沉積物中微生物群落結構在門和屬水平上沒有明顯差異，但其在各湖區間相對豐度差異顯著。在門水平上，湖心區沉積物中Chloroflexi的豐度顯著高于其他2個湖區（P＜0.05），這與湖心區有機污染嚴重有關；在屬水平上，湖北區沉積物樣品中P9X2b3D02豐度顯著高于其他2個湖區（P＜0.05），說明該菌屬更適宜在水生植物豐富的環境下生長繁衍。

（3）沉積物中TOC濃度是衡水湖水體沉積物中微生物群落結構的關鍵影響因素，TOC濃度與微生物菌屬的高相關性與沉積物有機污染嚴重有關，加強湖區植物殘體清除和底泥疏浚是控制衡水湖內源污染的重點。