MT01抑制Pg感染小鼠單核/巨噬細胞內NLRP3 mRNA的表達

郭 恪 申玉芹 丁子清 周 岳 于海蛟 林崇韜

(吉林大學口腔醫學院牙周病科,吉林 長春 130021)

牙周病是一種慢性感染性疾病，已有研究表明，NLRP3炎癥小體作為天然免疫的重要組分與牙周病的發生發展具有密切關系〔1，2〕。單核/巨噬細胞作為牙周宿主防御機制的重要組成部分，在動員宿主的抗菌防御中發揮重要作用〔3〕。由于能被多種類型的病原體或危險信號所激活，作為炎癥反應的核心，NLRP3炎癥小體可能為各種炎癥性疾病的治療提供新的靶點〔4〕。如果能抑制NLRP3炎癥小體的激活，可能對干預牙周病具有積極作用。在前期研究中發現，MT01是一類根據人線粒體DNA序列設計的單鏈寡脫氧核苷酸，具有選擇性免疫負調節活性，能在大鼠牙周炎模型中抑制牙槽骨吸收，并且能抑制由TLR9激活引起的固有免疫應答反應〔5,6〕。本實驗通過探討 MT01 對小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7內NLRP3 mRNA表達的影響，尋求可抑制NLRP3炎癥小體激活的方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 MT01(吉林大學基礎醫學院分子生物學教研室設計，TAKARA合成)，牙齦卟啉單胞菌Pg ATCC33277(中國醫科大學口腔醫學院中心實驗室提供)，小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7(ATCC號：TIB-71,American Type Culture Collection)，低糖DMEM培養基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(PAA公司，奧地利)，腦心浸萃液態培養基(BHI-S,Gibco)，6孔培養板(COSTAR，美國)，10 cm細胞培養皿(Corning公司，美國)，RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)，反轉錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，日本)，超凈工作臺(蘇州宏瑞凈化，中國)，CO2恒溫細胞培養箱(SANYO 公司，日本)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)紫外分光光度儀(BIO-RAD 公司,美國)，M×3005P熒光定量PCR儀(Stratagene,美國)。

1.2細菌及細胞培養

1.2.1實驗凍干菌株Pg ATCC33277，復蘇，接種于新鮮配制的BHI液體培養基(5%無菌脫纖維羊血，5 μg/ml氯化血紅素，1 μg/ml維生素K1)37℃厭氧培養5～7 d，挑單克隆菌落接種于液體培養基中培養48 h，在波長600 nm的紫外分光光度計下測細菌密度，調制備用。

1.2.2RAW264.7細胞，復蘇，接種于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養基中。置于5%CO2，37℃培養箱中培養生長。隔日換液，待細胞長滿平皿的80%～90%，用細胞刮輕柔地將貼壁的細胞刮下，吹打混勻，按1∶2傳代。

1.3人工設計合成MT01 設計合成MT01 (5′-ACC CCC TCT ACC CCC TCT ACC CCC TCT-3′)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至母液濃度0.1 μg/μl，-20℃保存備用。

1.4實驗分組 將RAW264.7細胞以4.5×105個/孔接種于6孔板中。待12 h細胞完全貼壁后，換無血清的培養液饑餓24 h。分為Pg組、MT01組、Pg+MT01組和只加PBS的對照組。(按細菌100∶1的感染復數，MT01的工作濃度1 μg/ml分別制成不同的混合液)分別培養6 h。

1.5實時定量PCR檢測NLRP3 mRNA的表達 將上述分組的細胞孵育6 h后，按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，各組取4 μg總RNA逆轉錄合成CDNA，再取逆轉錄產物進行實時定量PCR 的檢測。引物由Takara公司設計合成，以GAPDH內參基因。GAPDH 前向:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；NLRP3 前向:5′-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3′，反向:5′-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3′。實時定量PCR反應體系：引物(10 μmol)各0.5 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，DyeII 0.5 μl，模板cDNA 2 μl，蒸餾水dH2O補足總體積至25 μl。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30～34 s，95℃延伸15 s，循環40次。利用M×3005 P熒光定量PCR儀聯機軟件進行Ct值相對定量分析。

1.6統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行分析，采用配對樣本t檢驗。

2 結 果

2.1RAW264.7細胞形態學表現 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態以類圓形和多邊形為主，并有較長的突觸，一般以單核為主，少數有2個核。細胞生長較快，5～6 d可匯合。見圖1。

圖1 RAW264.7細胞形態學表現

2.2Pg生長形態 在BHI平板上厭氧培養5～7 d，可觀察到典型的黑色菌落。

2.3MT01干預Pg感染的RAW264.7內NLRP3 mRNA的表達 與PBS對照組相比，MT01組NLRP3 mRNA表達最低(P<0.05)，Pg組NLRP3 mRNA表達最高(P<0.01)，Pg+MT01組NLRP3 mRNA表達低于Pg組，高于MT01組和PBS組(P<0.01)。

3 討 論

NLRP3的異常調節與炎癥性疾病密切相關，細菌、真菌及病毒等都可以通過組織損傷、代謝異常等導致的宿主天然免疫應答激活NLRP3〔4〕，NLRP3在天然免疫系統中具有重要的調控作用〔7〕。Bostanci等〔8〕研究表明，在牙齦炎和牙周炎患者牙齦組織中NLRP3 mRNA的表達顯著高于健康組，且NLRP3 mRNA的表達與白細胞介素(IL)-1β和IL-18呈正相關。

本實驗結果表明MT01對RAW264.7內NLRP3 mRNA的表達具有顯著的抑制作用。已有的研究〔5〕表明，MT01能抑制由病原菌感染引起的過度有害的免疫反應，維持機體的免疫平衡，防止組織細胞受到損傷前期工作發現，MT01對大鼠牙周炎引起的牙槽骨吸收具有明顯的抑制作用〔6〕，但其機制不明。本研究結果提示，MT01對大鼠牙周炎的調控作用可能是由于其對NLRP3激活的抑制作用引起。

作為目前公認的牙周炎致病菌，Pg可誘導人單核/巨噬細胞發生壞死樣細胞死亡，且這一過程與NALP3有關〔9〕。本實驗結果表明，Pg刺激后，巨噬細胞RAW264.7內NLRP3 mRNA的表達異常增高，說明Pg感染可導致NLRP3的激活，進而引發一系列的免疫調控反應。實驗中采用MT01對Pg感染進行干預，發現MT01可顯著下調Pg感染所引起的RAW264.7內NLRP3 mRNA的表達水平。

上述結果說明MT01不僅可以抑制NLRP3 的激活，而且能夠抑制Pg感染所導致的NLRP3的表達，提示MT01對NLRP3活化的干預可能成為抑制牙周感染的一種策略。

4 參考文獻

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