基于拓撲指數的QSAR 法探討腦泰方中抗腦血栓關鍵活性成分簇

張玉超 ，鐘鵬英 ，夏 凡 ，李世雄，李瓔峪，葛金文，劉文龍*，張喜利*

1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

化合物的生物效應、理化性質與其結構之間存在一定關聯性，而拓撲指數則是能定量表征化合物構效關系的一種參數。在定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）研究[1]中，以拓撲指數為基礎建立化學結構與其生物效應和理化性質之間關系的方法被廣泛應用，如預測化合物活性、設計人工合成活性藥物[2]等。分子連接性指數（molecular connectivity index，MCI）是由Randic 于1975 年提出并由Kier 和Hall 等人發展形成的新的拓撲學參數。MCI 能夠對分子進行定量描述（如大小、分支、環、不飽和度、雜原子等），充分反映分子的連接信息和化學環境，與分子的多種理化性質（液體密度、沸點、水溶性、油水分配系數、溶解度、極化率等）及生物效應（麻醉活性、酶抑制活性、抗菌活性、致幻活性、毒性等）密切相關[3-7]。目前研究表明MCI 可以與化合物色譜相對保留時間[8]、生物降解速率[9]、腦梗死面積[10]、抗新冠病毒活性[11]等相關聯，具有較強的預測能力。

近年來，心腦血管疾病發病率逐年上升，嚴重威脅人類的身體健康。研究表明血栓的形成是心腦血管疾病的主要病因。腦卒中是一種急性腦血管疾病，卒中發病率在我國總體呈現不斷上升的趨勢[12]，是全球第2 大死因[13]。一般認為腦血栓的形成是由于動脈血管壁病變，多表現為動脈粥樣硬化以及斑塊形成，阻塞血管引起頸動脈狹窄，導致相應腦部供血區供血不足[14]。西醫多采用溶栓、抗血小板聚集、降纖、腦保護等方法進行治療[15]。中醫藥理論認為，腦血栓屬于“中風”范疇，其形成與“風、虛、火、痰、瘀”密切相關[16]。病理機制屬于陰陽失調、氣血逆亂。故中醫藥治療腦血栓多為減少腦部血液瘀滯、改善腦組織微循環、促進神經元功能的恢復[17]。

中藥復方腦泰方又名芪龍方，是湖南中醫藥大學葛金文教授基于中醫基礎理論，在補陽還五湯基礎上結合臨床經驗加減藥味而成。腦泰方由黃芪、川芎、僵蠶、地龍4 味中藥構成，其中黃芪為君藥，川芎為臣藥，僵蠶和地龍為佐藥，具有活血益氣、通絡化痰的功效，常用于治療氣虛血瘀型腦梗死，臨床療效顯著[18-19]。近年來的相關研究表明，腦泰方的作用機制是抗血小板活化、抗血栓形成，降低全血黏度[20]；通過靶向激活Notch 信號通路、促進小神經膠質細胞（microglia，MG）極化等增強神經元抗凋亡能力[21]；抑制白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路達到抗炎性作用[22]；上調熱休克因子1/熱休克蛋白B1（heat shock factor 1/heat shock proteins B1，HSF1/HSPB1）通路調控鐵代謝穩態平衡，以及調控脂質氧化-鐵代謝通路來抑制神經元鐵死亡等。然而腦泰方發揮抗腦血栓作用的有效成分群（簇）卻鮮有報道。

本研究以中藥復方腦泰方為模型中藥，以能多方位定量表征分子結構特征的多層級MCI 為窗口，利用自編軟件計算0～8 階/8 種子圖類型MCI 值，每個成分可計算獲得72 個MCI 值，此72 個MCI值從不同角度、不同程度定量描述了相應分子的結構特征。倘若有n個成分即可構成n×72 的矩陣，采用夾角余弦法計算各成分兩兩之間的相似度，以捕捉2 種化學成分的結構差異性。與目前公認的療效確切的化學藥進行相似度分析，根據構效關系規律便可高通量篩選出潛在的中藥活性成分簇。

1 材料與方法

1.1 腦泰方成分MCI 的計算

1.1.1 腦泰方化學成分收集 檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP[23]，查閱國內外與腦泰方的相關文獻報道[24-31]，分別總結出黃芪63 種、川芎88 種、僵蠶53 種、地龍49 種化學成分及其結構信息。根據中藥有效成分特征對上述253 種成分進行分類。

1.1.2 抗血栓化學藥信息收集 根據腦泰方的藥理作用，查閱《中國藥典》2020 年版[32]及相關文獻報道[33-34]，找到相應抗血栓化學藥（阿司匹林、氯吡格雷、雙嘧達莫、依達拉奉、華法林）及其化學結構信息。

1.1.3 MCI 及其相似度計算 MCI 是在Randic 分支基礎上發展起來的點價計算方法，是研究QSAR的有效手段。目前本團隊已有軟件程序可計算0～8階MCI。本研究通過實驗室自編MCI 軟件完成各成分MCI 的0～8 階的計算，其通用公式如下。

mXt為m階的MCI；t代表子圖類型數；s為m階項下m+1非氫原子的組合形式；δ為原子i的非原子點價，即與原子i相連接的其他非氫原子數目；Nm為階數為m的t類型子圖的數目

隨著階數m的增高，mXt表達的結構信息能力亦增強，可獲得m×t的矩陣數據信息集。本研究階數為0～8 階，類型子圖t為8，能獲得72 個MCI數據信息集（以毛蕊異黃酮為例，其MCI 計算數據集見圖1），按圖1 的方法可獲得18 576（258×72）個MCI 值。對于兩兩72 個MCI 數據信息集可按夾角余弦法計算其相似度，從而推斷腦泰方中發揮與化學藥相似藥理作用的化合物類群。將兩矩陣看成是二維數組向量，任意矩陣數組元素為aij和bij，相似度[35]的公式如下。

圖1 毛蕊異黃酮結構及0～8 階MCIFig.1 Structure of calycosin and MCI of order 0 to 8

1.2 分子對接及網絡藥理學研究

1.2.1 腦泰方化合物篩選及靶點預測 通過前期MCI 相似度的計算篩選出腦泰方20 個活性成分，利用TCMSP 數據庫、Swiss target 數據庫預測活性成分的靶點，匯總后剔除重復項。

1.2.2 疾病靶點蛋白的獲取 在Geencards 數據庫（https://www.genecards.org/）檢 索“ cerebral thrombosis”，以相關性系數≥10 為篩選條件，核實靶點基因名，搜索蛋白質PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/），選取與抗腦血栓相關的關鍵靶點蛋白，得到其3D 結晶結構，所有蛋白均來源于人種。

1.2.3 交集治療靶點蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建 應用韋恩圖分析得到腦泰方與抗腦血栓的交集靶點，將交集靶點導入 STRING 蛋白數據庫（https://cn.stringdb.org/）分析，將物種設置為“Homo sapiens”，combined score＞0.4 為篩選條件，得到交集靶點的PPI 網絡。用Cytoscape（version 3.9.1）對交集靶點的PPI 網絡進行分析，利用“Network Analyzer”模塊計算度（degree）值，按照度值大小構建PPI 網絡。

1.2.4 分子對接驗證 為進一步驗證靶點預測結果的可靠性，將腦泰方的活性成分與預測的核心靶點進行分子對接驗證。提取核心靶點蛋白晶體結構，去除結晶水、加氫和除去側鏈的殘基，有配體的蛋白晶體根據配體暴露活性位點生成活性口袋、無配體晶體結構采用自動模式生成活性口袋。去掉水分子和加氫等優化處理后保存為SFXC 文件，按默認參數將靶點與腦泰方活性成分進行對接后，得到每個分子與靶標的對接得分（total score）值。使用total score 評價成分-靶點的結合力度，total score≥5 表示成分-靶點存在較強的相互作用[36]。采用Sybyl-X 2.1 軟件對本研究的對接方法進行方法學驗證。

2 結果與分析

2.1 腦泰方各成分相似度

通過MCI 計算公式并配合實驗室自編的MCI計算軟件可得到腦泰方253 個化合物的MCI 信息集，再用相同方法可得出各類抗腦血栓化學藥成分的信息集，并計算出各類化學藥的平均MCI，將所有化合物與化學藥標準品的平均MCI 進行相似度對比，得出腦泰方中所有化合物0～8 階矩陣的MCI相似度。結果發現，黃芪與5 種抗血栓化學藥的平均MCI 相似度在0.674 2～0.996 1，川芎與5 種抗血栓化學藥平均MCI 相似度在0.602 1～0.997 8，僵蠶與5 種抗血栓化學藥的平均MCI 相似度在0.300 6～0.996 9，地龍與5 種抗血栓化學藥的平均MCI 相似度在0.384 5～0.992 7。其中各味藥中平均MCI 相似度排名前5 的化合物如表1 所示（考慮到數據量過多以及3～8 階的數據易缺失，故采用比較具有代表性的0～2 階）。腦泰方中各味藥相似度排名最高的成分為黃芪的毛蕊異黃酮（0.996 1）、川芎的洋川芎內酯M（0.997 8）、僵蠶的白僵菌素（0.996 9）、地龍的肌苷（0.992 7）。

2.2 腦泰方單味藥中各類成分的0X～8X

通過公式計算得到腦泰方中黃芪、川芎、僵蠶、地龍各類成分的0X～8X，如表2 所示。結果發現黃芪的0X～8X平均值在0.95～13.52，川芎的0X～8X平均值在1.06～4.43，僵蠶的0X～8X平均值在1.25～10.08，地龍的0X～8X平均值在0.78～5.74。

表2 腦泰方中單味藥中各成分群的0X～8XTable 2 0X—8X of each component group from single medicine in Naotaifang

2.3 腦泰方對腦血栓的共同治療靶點

通過腦泰方成分與抗血栓化學藥MCI 相似度的計算，篩選出腦泰方20 個活性成分，主要包括毛蕊異黃酮、芒柄花苷、大豆素、毛蕊異黃酮苷、洋川芎內酯M 等（表1）。利用化合物靶點預測得到腦泰方治療腦血栓的靶點356 個。從疾病數據庫對腦血栓的靶點進行整理，得到疾病靶點202 個。運用在線分析工具Venny 得到交集靶點28 個，見圖2。

圖2 腦泰方活性成分與腦血栓交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection target of active ingredient in Naotaifang and cerebral thrombus

2.4 PPI 網絡分析

將篩選出的腦泰方活性成分和腦血栓交集靶點作為潛在核心靶點進行PPI 網絡分析，見圖3。28個靶點中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、白細胞介素-10（interleukin 10，IL10）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、γ 干擾素（interferon gamma，IFNG）、環加氧酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）等靶點排名靠前。度值是指節點在整個網絡中的連接數，其反映了節點之間的交互信息，是作為核心靶點的重要參考，度值越大，說明節點在網絡中越重要，作用越關鍵。根據度值＞中位數[37]篩選核心靶點，得到核心靶點13 個。

圖3 交集靶點PPI 網絡Fig.3 PPI network of intersection target

2.5 分子對接驗證

為了更好地闡明腦泰方活性成分與核心靶點之間的相互作用，運用Sybyl-X 2.1.1 軟件將潛在活性成分與核心靶點對接，分子對接示意圖見圖4。成功對接后，為活性成分和蛋白分子間的對接狀態計算出total score（表3），total score 值越高，說明親和力越強。分子對接結果顯示，腦泰方活性成分毛蕊異黃酮、洋川芎內酯M、肌苷、白僵菌素等分別與預測的核心靶點PTGS2、腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）、凝血因子III（coagulation factor III，F3）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、淀粉樣前體蛋白（amyloid beta precursor protein，APP）等的total score 值均超過5，顯示出較強的結合能力。結合已有文獻，發現預測成分群參與腦血栓相關機制調節已有部分見報道，如黃芪的黃酮類、川芎的苯酞類；相關靶點參與腦血栓相關機制的調節也已有部分報道，如TNF[38]、IL10[39]、MMP9[40]、PTGS2[41]等，確屬腦泰方發揮藥效的有效成分群和作用靶點。

圖4 部分成分與核心靶點分子對接圖Fig.4 Molecular docking diagram of part components and core target

表3 腦泰方活性成分與腦血栓核心靶點結合分數Table 3 Total score of active ingredient in Naotaifang combined with core target of cerebral thrombus

2.6 結果分析

由表1 可知，腦泰方單味藥中黃芪MCI 相似度排名前5 的化合物為毛蕊異黃酮、芒柄花苷、大豆素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷；川芎MCI 相似度排名前5 的化合物為洋川芎內酯M、洋川芎內酯I、洋川芎內酯R、洋川芎內酯J、1β-acrylate-7-aldehydoβ-carboline；僵蠶MCI 相似度排名前5 的化合物為白僵菌素、6-甲氧基-7-氧-β-D-(4＇-甲氧基)-吡喃葡萄糖基香豆素、胞苷、尿核苷、木犀草素；地龍MCI相似度排名前5 的化合物為肌苷、尿苷、腺苷、鳥苷、色氨酸。其中黃芪的黃酮類、川芎的苯酞類、僵蠶的核苷類、地龍的核苷類占比最大，初步推斷這幾類成分為腦泰方中起抗血栓作用的主要成分群。由表2 可知，黃芪黃酮類的0X～8X平均值與腦泰方的0X～8X平均值（3.01）接近，推測其可能為腦泰方中發揮功效的主要成分群。區海燕[42]從黃芪總黃酮提取物中分離出毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷4 種活性成分，且后續實驗表明給予氣虛證模型小鼠一定量黃芪黃酮后，氣虛證模型小鼠的血漿黏度、全血還原黏度出現了不同程度的下降，其表觀特征和負重游泳時間都恢復至正常水平，表明黃芪黃酮具有“提氣”作用。黃芪在腦泰方中為君藥，發揮補氣功效，藥力居方中之首。實驗研究表明，毛蕊異黃酮[43]、刺芒柄花素[44]、毛蕊異黃酮苷[45]都具有明確的抗腦血栓作用。由表1 可知，毛蕊異黃酮的MCI相似度最高，為0.996 1。綜合推測以毛蕊異黃酮為代表的黃芪黃酮類成分在腦泰方中發揮補氣功效，為抗血栓的主要成分群。劉珊珊等[46]研究表明川芎苯酞類成分能夠上調緊密連接蛋白表達，抑制氧糖剝奪/再灌注誘導的MDCK-MDR1 細胞損傷，有利于配伍藥物的跨膜轉運。由表1 可知川芎中MCI 相似度排名最高的是洋川芎內酯M，為0.997 8。川芎為臣藥，輔助君藥加強治療主病和主癥，推測以洋川芎內酯M 的川芎苯酞類成分為腦泰方中發揮輔助抗血栓作用的主要成分群。僵蠶中MCI 相似度排名最高的為白僵菌素，有研究表明，白僵菌素是僵蠶中發揮藥理作用的主要成分[47]。核苷類化合物參與細胞代謝和生物體內生理調節過程，在地龍中含量十分豐富[48]。地龍、僵蠶均為佐藥，用于治療

次要兼癥，輔佐臣藥發揮藥理作用，結合計算結果推測僵蠶的氨基酸類成分白僵菌素、地龍的核苷類成分肌苷為發揮作用的主要成分群。周瑜等[49]采用低、中、高劑量的腦泰方治療血栓模型小鼠，發現腦泰方各劑量組可以使大鼠血栓形成時間明顯延長，表明腦泰方具有一定的抗血栓作用。有研究表明腦泰方通過抑制鐵死亡保護腦卒中缺血損傷[50]，臨床研究[19]也證明腦泰方對氣滯血瘀型腦梗死有良好的治療作用，臨床效果顯著。綜上說明腦泰方通過多種成分群共同發揮抗血栓作用。

3 討論

腦血栓的形成屬于中醫的“中風”范疇，起病急驟、變化迅速，其病理基礎為氣血逆亂、氣虛血瘀，治療核心環節為益氣活血。中藥復方腦泰方是以清代醫家王清任《醫林改錯》中的補陽還五湯為基礎，結合臨床經驗加減藥味而得，是治療腦梗死的有效方劑。該方以氣補通、以通助補，益氣與活血交互作用、相互協同，能減少腦部血液瘀滯，改善腦供血障礙、腦組織微循環，促進神經元功能的恢復。

超分子印跡屬于超分子化學中主客體化學研究范疇，超分子印跡模板是化學上的分子結構概念[51]，與藥理學經典的受體-配體理論相似，但存在不同之處。印跡模板是主客體分子間有效基團的空間點陣結構，可以用MCI 進行定量表示。一定程度上，化學成分MCI 相同或相近反映了其生理活性和藥物理化性質相同或相近。本研究通過收集整理中藥復方腦泰方化學成分，基于構效關聯性，利用MCI 將傳統中藥中的化學成分與現代臨床常用化學藥相關聯。相似度排名前5 的化合物中，黃芪的黃酮類成分、川芎的苯酞類成分、地龍的核苷類成分占比最大，進一步推斷黃芪的毛蕊異黃酮、川芎的洋川芎內酯M、僵蠶的白僵菌素、地龍的肌苷為腦泰方中起抗血栓作用的主要分子群。

中藥復方是多成分、多靶點在體內復雜環境下相互作用發揮藥理作用，而簡單的MCI 未能考慮客體分子真實的化學環境。本研究對比發現中藥各類成分平均MCI 有一定差異。原因可能為數據庫的化合物數據有待完善，或是各類成分歸類較簡單，造成結果產生差異。后續實驗將對腦泰方及其相對應的化學藥進行擴展研究，基于文獻加強中藥化學成分研究，增加其所含化合物數量并進一步優化，逐級深入篩選臨床常用化學藥并按照藥理學進行歸類，與腦泰方各成分平均MCI 進行相似度對比。拓撲指數與藥理效應關聯性研究的方法，并進行動物、細胞實驗進行佐證，是闡明中西藥間相關聯的活性成分群的新方法。基于多種中西藥之間超分子結構研究，同時探究銜接中西藥之間的現代化聯系，也是跨過繁瑣的實驗驗證過程最有力的研究手段。本研究為中藥質量及現代化研究提供了新思路、新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突