不同的細胞保存液對自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞短期保存的影響

仇欣霞，張麗華，陳荷，董為人*

（1.南方醫科大學實驗管理中心，國家級醫學基礎實驗教學示范中心，國家級醫學形態學虛擬仿真實驗教學中心，廣東 廣州 510515；2.佛山科學技術學院醫學院；3.南方醫科大學第三附屬醫院神經外科）

隨著免疫細胞生物學的快速發展，免疫治療已成為腫瘤治療的重要手段之一。細胞免疫治療療法，又稱為過繼免疫治療，是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量成千倍增多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力［1-2］。用于細胞免疫治療療法的免疫細胞主要有自然殺傷細胞（natural killer cell，NK 細胞）［3］、自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT細胞）［4］等。細胞收集后，需要用保存液重懸再由實驗室轉運到臨床。因自體免疫細胞治療是個體化治療，細胞制品與普通的生物制品和藥品不同，如何在運輸過程中保持免疫細胞的最大活性及其原有生物學性質，確保最終應用于治療的細胞達到統一的質量標準成為了免疫治療的關鍵。因此本研究探討4 ℃條件下短時間內3種不同的保存液對免疫細胞保存的影響，為免疫細胞治療前細胞保存的標準化、統一性、科學性提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用外周血均采自于課題組健康志愿者，血液標本4項傳染病檢測及血常規和凝血功能正常。根據國務院《醫療機構管理條例》規定，志愿者對實驗知情同意。人慢性髓原白血病K-562細胞由本實驗室提供。生理鹽水（四川科倫藥業公司），人血白蛋白（human serum albumin，HSA）（西班牙GRIFOLS 公司），低分子右旋糖苷注射液（廣東雷允上藥業公司），NKT細胞培養基（瑞士Lonza 公司），Lymactin-NK 抗體及NK 細胞培養基（珠海貝索生物技術有限公司）。IL-2（北京雙鷺藥業股份有限公司），IL-21、IL-15（上海澤葉生物科技有限公司），OKT3及標記抗體CD3、CD56、CD16（美國BD 公司）。BD Accuri C6 流式細胞儀、3111 型細胞培養箱、ST40 大容量離心機（美國Thermo 公司），Countstar Biotech 細胞計數儀（上海睿鈺生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 NK 和NKT 細胞培養 抽取4位志愿者外周血各40 ml，經Ficoll 淋巴細胞分離液分離得到外周血單個核細胞，均分成2 份。分別按照NK 細胞、NKT 細胞培養方案進行培養。接種于T25 的培養瓶內，一份加入IL-2 和Lymactin-NK 抗體誘導成NK 細胞，一份加入IL-21、OKT3、IL-15、IL-2 抗體誘導成NKT 細胞，并用培養基調整細胞密度為3×106/ml。參考文獻［5-6］及前期預實驗結果，每天觀察細胞，根據細胞生長狀況，以后每2～3 d適當補充細胞因子及淋巴細胞培養基，控制細胞密度在（1～2）×106/ml，根據培養情況轉移至細胞袋培養。

1.2.2 NK 和NKT 細胞收集及分組保存 按照NK和NKT 細胞的培養方法分別培養細胞直至11 d 以上。然后將細胞充分混勻，計數。待細胞總量達到6×108以上時，停止培養，收集細胞。根據免疫細胞回輸濃度，將培養好的8 份免疫細胞（NK 細胞4份、NKT細胞4份）分別收集并應用生理鹽水（保存液A）、生理鹽水+5%HSA（保存液B）、生理鹽水+5%HSA+1%低分子右旋糖苷（保存液C）3 種保存液在4 ℃條件下保存，裝入轉移袋內，每份保存液體積為50 ml。在細胞存放0、6、12、24 h時分別進行細胞活率、結團率、流式細胞術及殺傷性檢測。

1.2.3 不同保存液中的細胞活率及結團率檢測在細胞存放0、6、12 和24 h 時，將保存液中的細胞充分混勻；取1 ml細胞懸液，按細胞懸液∶0.2%臺盼藍（v∶v）＝1∶1 的比例充分混勻。取20 μl細胞混勻液加入細胞計數板中，用Countstar 細胞計數儀進行細胞活率及結團率檢測，重復3次。

1.2.4 不同保存液中細胞的流式細胞術檢測 在細胞存放0、6、12 和24 h 時，將培養細胞充分混勻，取細胞懸液5 ml，調整細胞密度為1×106/ml，分別取CD3、CD56 的單克隆抗體各2 μl，加入細胞懸液500 μl，室溫下避光孵育20 min，同時設立空白同型對照，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，生理鹽水洗滌2 遍后，用200 目篩網過濾細胞樣品重懸上機檢測。

1.2.5 K-562 細胞的培養 復蘇K-562 細胞株，轉移至加有RPMI-1640 培養基＋10%胎牛血清的培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中擴增培養待用。

1.2.6 殺傷實驗 在細胞存放0、6、12 和24 h 時將培養細胞充分混勻作為效應細胞，K-562細胞作為靶細胞。實驗分效應細胞+靶細胞組、效應細胞組、靶細胞組，每組3 個復孔。取對數生長期的K-562 細胞，調整其濃度為2×105/ml。將NK、NKT 的細胞濃度調整為2×106/ml，按照效靶比為10∶1 的比例加入96 孔板中。96 孔板中，效應細胞+靶細胞組每孔加效應細胞、K-562 細胞各100 μl；靶細胞組每孔加入K-562 細胞、RPMI-1640 培養液各100 μl；效應細胞組每孔加入效應細胞、RPMI-1640 培養液各100 μl。置于培養箱中培養24 h，然后每孔加入CCK-8 試劑10 μl，37 ℃孵育4 h，全自動酶標儀（波長490 nm）檢測光密度，計算殺傷率。殺傷率=［1-（效應細胞加靶細胞孔吸光度值-效應細胞孔吸光度值）/靶細胞孔吸光度值］×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，正態分布計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量的方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同保存液中的細胞活率及結團率檢測 存放至12 h 時，NK 細胞及NKT 細胞的A 組保存液中的細胞活率低于85%，與其他2組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；存放至24 h 時，各組細胞活率均低于85%，但A 組保存液中的細胞活率明顯低于B、C 組（P＜0.05）。存放12、24 h 時，B組和C 組保存液中細胞結團率均低于A 組，且存放24 h 時，C 組的結團率低于B 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 NK細胞和NKT細胞在3種保存液中存放不同時間后的活率及結團率的統計分析圖

2.2 不同保存液中細胞的流式細胞術檢測 將各組保存液中的NK 細胞和NKT 細胞在0、6、12 和24 h 時分別進行細胞表面標記抗原流式鑒定。結果分別與0 h比較，各組各時間點的細胞表面標記均未出現明顯變化（P＞0.05）。見圖2及表1、2。

表1 各時間點NK細胞表面標記的流式結果變化（，%）

表1 各時間點NK細胞表面標記的流式結果變化（，%）

圖2 NK細胞和NKT細胞在3種保存液中存放不同時間的流式細胞圖

表2 各時間點NKT細胞表面標記的流式結果變化（，%）

表2 各時間點NKT細胞表面標記的流式結果變化（，%）

2.3 不同保存液中的細胞殺傷實驗 殺傷實驗結果顯示，無論是NK細胞還是NKT細胞，存放24 h時，各組細胞殺傷力與0 h 比較，均出現明顯下降（P＜0.05）。存放12 h 時NK 細胞和NKT 細胞的A組細胞與C 組比較，殺傷作用明顯減弱（P＜0.05）；存放24 h時NK細胞、NKT細胞的A組、B組與C 組相比殺傷力下降更明顯（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組NK細胞、NKT細胞殺傷力檢測統計圖

3 討論

從2011 年美國洛克菲勒大學教授Ralph M.Steinman 因“發現樹突狀細胞及其在獲得性免疫中的作用”［7-8］而獲得諾貝生理學或醫學獎到2013年Science 雜志把腫瘤免疫治療列為年度重大科學突破［9］，再到發現以PD1 為核心藥物的免疫檢查點抑制劑療效更顯著［10］，世界范圍內已經掀起了開發免疫療法的熱潮，免疫治療已成為腫瘤治療最具價值和潛力的治療手段［11］。

NK 細胞是機體重要的天然免疫細胞，占外周血淋巴細胞的比例約10%～20%。它不僅參與免疫調節，也與抗腫瘤密切相關［12］。近年來，越來越多的研究證明了NK 細胞加入了抗癌行列［13］。NKT 細胞是體內重要的執行免疫調節功能的特殊的T 淋巴細胞亞群，通過分泌細胞因子來調節免疫系統的功能。因此在體外得到高增殖活性的NK和NKT 細胞，然后回輸給免疫系統功能低下的機體，可增強體內免疫監視和清除功能，提高機體抗衰老的能力，降低疾病風險［14-15］。

無論臨床應用哪種免疫細胞治療疾病，都必須遵循《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》，為臨床免疫細胞治療提供安全有效的細胞產品［16］。隨著腫瘤免疫細胞治療的飛速發展，細胞進行短時內的保存和運輸勢必會越來越頻繁。如何最大限度保證短期內保存袋內的細胞生物學特性不發生變化是許多實驗室人員的探索目標。這其中包括保存液的成分、保存的時間和溫度等。已有大量實驗證明，無論是免疫細胞還是干細胞，在4 ℃恒溫條件細胞狀態最好［17-19］。因此本實驗主要研究在4 ℃條件下不同的保存液成分對NK 細胞和NKT 細胞短期保存的影響。因為生理鹽水的滲透壓值和正常人的血漿、組織液都是大致一樣的，所以我們將它用作保存液的主要成分。本研究結果發現，僅僅使用生理鹽水做保存液的A 組，在保存12 h 時細胞就出現明顯結團，活率下降，殺傷力也隨之下降。隨著時間延長，細胞內產生自由基，發生氧化反應，從而引起細胞間及細胞與容器間發生黏附，結團率上升［20］。在B 組保存液中，加入HSA。HSA 是從健康的人體血漿中分離提取的，經一定溫度和時間處理滅活后得到，目前在臨床上經常用于休克、顱內壓升高及低蛋白血癥等。除此以外，研究還發現HSA 在細胞保存中能起到防止細胞結團和維持細胞膜穩定性的作用，同時還能維持細胞液滲透壓的穩定［21-22］。本研究結果發現，B組和C組細胞在12 h細胞結團率較低。低分子右旋糖酐，通常為血容量擴充劑，給予它可以提高血漿膠體滲透壓，增加血容量，減低血小板黏附性并抑制紅細胞凝聚，改善微循環能力等［23］。為了降低細胞結團率，C 組聯合使用HSA 和低分子右旋糖苷，到24 h 時此組的細胞結團率較低，與其他2 組比較差異有統計學意義，活率和細胞殺傷力相對較高，而且這保存液配制方法也很簡便易得，適合免疫細胞的臨床保存和運輸使用。

本實驗通過對不同保存液中NK 細胞和NKT細胞在4 ℃條件下短期保存的活率、結團率及殺傷力等方面影響的探討，發現NK 細胞和NKT 細胞在生理鹽水+5%HSA+1%低分子右旋糖苷保存液中存放效果最佳，但也不應超過24 h。此次實驗初步為免疫細胞保存的科學性、標準化做了探索并提供了科研依據。