帕博西尼聯(lián)合他莫昔芬對乳腺癌細胞T-47D的作用研究*

孫 俊，廖 林，賈毅敏

(重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院藥學部 400030)

乳腺癌在我國發(fā)病率和病死率分別位于女性惡性腫瘤的第1位和第4位[1]，且近25年全球女性乳腺癌死亡率明顯上升[2]。帕博西尼是高度選擇性細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)和細胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)抑制劑，被批準用于激素受體陽性、人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)陰性進展期乳腺癌的一線、二線治療[3-4]，但帕博西尼單藥使用效果不佳[5]，其聯(lián)合內分泌療法已經(jīng)用于治療晚期乳腺癌患者。他莫昔芬為雌激素受體拮抗劑，可與乳腺癌細胞表面的激素受體結合，抑制乳腺癌發(fā)生、發(fā)展[6]，其是用于內分泌輔助治療激素受體陽性、HER-2陰性乳腺癌患者的常用藥物，可降低疾病復發(fā)和擴散，提高患者生存率[7]。大約50%長期使用他莫昔芬的乳腺癌患者可產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。而聯(lián)合用藥可降低細胞耐藥性，同時增加乳腺癌細胞對藥物的敏感性[8-9]。本實驗以帕博西尼聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌細胞T-47D進行干預，探討二者聯(lián)合使用對其細胞增殖、凋亡和免疫功能的影響及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

全自動酶標儀購自美國Molecular Devices公司；Western blot電泳儀和轉膜儀購自美國Bio-rad公司；FACScan流式細胞儀購自美國BD公司；高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter公司；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要試劑與藥品

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；MTT試劑、鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司；10% SDS溶液、蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒、熒光標記二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V-FITC/PI流式凋亡試劑盒購自美國BD公司；Bax多克隆抗體、cyclin D1多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；cleaved-caspase3購自美國Protein tech公司；熒光標記二抗、Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司；ELISA檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。他莫昔芬(tamoxifen)購自阿斯利康投資(中國)有限公司；帕博西尼(palbociclib/PD0332991)購自美國Selleck Chemicals公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng)

將人乳腺癌細胞T-47D(上海細胞生物研究所)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，且置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期可用于實驗。

1.3.2MTT法檢測各組藥物濃度對細胞增殖的影響

用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期T-47D細胞，以每孔5×103個細胞/100 μL的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后加藥處理，帕博西尼組按照濃度梯度0、10、25、50、100 nmol/L處理，他莫昔芬組按照0、5、10、25、50 nmol/L濃度梯度處理，每組3個平行孔。細胞處理24 h后進行MTT檢測。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，加入100 μL DMSO 10 min后，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A值)并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。計算藥物對細胞生長的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)值。后續(xù)實驗均以帕博西尼和他莫昔芬IC50值為細胞給藥濃度。

使用金氏公式[10]計算帕博西尼和他莫昔芬聯(lián)合用藥的Q值。Q=Ea+b/(Ea+Eb- EaEb)，其中Ea和Eb分別為單獨藥物作用的抑制率，Ea+b為兩藥聯(lián)合作用的抑制率。Q>1.15表示兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用，0.85～1.15表示兩藥聯(lián)合具有相加作用，<0.85表示兩藥聯(lián)合具有拮抗作用。進行3次獨立重復實驗。

1.3.3流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組細胞5×104個，按照細胞凋亡試劑盒(Annexin V-FITC/PI雙染)說明書操作，檢測細胞凋亡情況。

1.3.4流式細胞術檢測細胞周期分布

收集各組細胞5×104個，按照細胞周期試劑盒(PI單染)說明書操作，檢測細胞周期分布情況。

1.3.5Western blot檢測蛋白表達

收集各組細胞，加入裂解液后超聲破碎，提取總蛋白。BCA測定蛋白濃度后，等量上樣。蛋白電泳，轉膜，封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBST漂洗5 min×3次，加入二抗溶液，室溫孵育1 h。PBST漂洗5 min×3次，使用Odyssey凝膠成像儀檢測蛋白顯色情況，Image J定量蛋白條帶。

1.3.6ELISA檢測細胞免疫抑制細胞因子分泌情況

各組藥物作用細胞24 h后，取細胞培養(yǎng)液按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測免疫抑制細胞因子分泌水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 單藥和聯(lián)合用藥對T-47D細胞增殖的影響

使用帕博西尼和他莫昔芬分別處理T-47D細胞24 h后的IC50分別為45.26 nmol/L和12.57 nmol/L。單獨用藥對T-47D細胞增殖抑制作用與藥物濃度呈正相關。與單藥組比較，聯(lián)合用藥組對細胞的增殖抑制作用明顯增加，經(jīng)金氏公式檢驗，Q值在(1.28±0.20)和(1.63±0.23)之間，提示帕博西尼和他莫昔芬聯(lián)合用藥對T-47D細胞具有明顯的協(xié)同作用，見圖1。

圖1 不同濃度的藥物單獨及聯(lián)合作用24 h后對T-47D細胞增殖的影響

2.2 單藥和聯(lián)合用藥對T-47D細胞凋亡和相關蛋白表達的影響

對照組、帕博西尼組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組細胞凋亡率分別為(9.23±0.18)%、(17.69±1.52)%、(23.67±2.71)%和(36.42±3.48)%。聯(lián)合用藥組較單藥組細胞凋亡率明顯增加，見圖2A。與對照組比較，帕博西尼組、他莫昔芬組及聯(lián)合用藥組細胞中，Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax和cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高，聯(lián)合用藥組變化更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B。

A：各組細胞凋亡率比較；B：各組相關蛋白表達。

2.3 單藥和聯(lián)合用藥對T-47D細胞周期及相關蛋白表達的影響

帕博西尼組阻滯[(39.36±2.51)%]細胞于G1/S期，他莫昔芬組阻滯[(48.52±1.17)%]細胞于G0/G1期,聯(lián)合用藥組阻滯[(62.36±5.31)%]細胞于G1/S期,見圖3A。與對照組比較，帕博西尼組、他莫昔芬組及聯(lián)合用藥組cyclin D1和p-Rb蛋白表達明顯降低，聯(lián)合用藥組變化更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3B。

表1 各組藥物對T-47D細胞TGF-β1、IL-10、PD-L1水平的影響

2.4 單藥和聯(lián)合用藥對T-47D細胞免疫抑制細胞因子分泌水平的影響

與對照組比較，帕博西尼組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組轉化生長因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素10(IL-10)、程序性死亡配體1(PD-L1)水平均明顯降低，聯(lián)合用藥組降低更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

A：各組細胞周期情況；B:各組細胞周期相關蛋白表達。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌細胞過度增殖、遷移和侵襲與疾病復發(fā)轉移緊密相關。CDK4和CDK6是細胞周期關鍵調節(jié)因子，觸發(fā)細胞周期從G1期(DNA合成前期)到S期(DNA合成期)，CDK4/6過度活躍可導致細胞增殖失控。帕博西尼是CDK4/6抑制劑，能夠與 CDK4/6結合，抑制RB磷酸化進而抑制轉錄因子E2F釋放，阻礙細胞由G1期進入S期，從而抑制腫瘤細胞DNA合成和細胞增殖[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在激素受體陽性、HER-2陰性、內分泌治療復發(fā)的晚期乳腺癌患者中，帕博西尼療效優(yōu)于安慰劑[12]。他莫昔芬是臨床上用于乳腺癌內分泌治療的主要藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，在激素受體陽性、HER-2陰性乳腺癌患者中，帕博西尼聯(lián)合內分泌治療可提高腫瘤細胞藥物敏感性，降低耐藥性，療效更好[11]。因此，本文主要研究帕博西尼聯(lián)合他莫昔芬對乳腺癌細胞T-47D細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期和分泌免疫抑制細胞因子功能的影響及其相關機制。

MTT實驗結果表明，帕博西尼和他莫昔芬對T-47D細胞的增殖具有協(xié)同抑制作用。帕博西尼通過改變細胞周期來抑制細胞增殖[13]，他莫昔芬是通過阻斷雌激素作用于乳腺癌細胞的信號通路來抑制細胞增殖[14]，而聯(lián)合用藥可能通過雙重機制協(xié)同抑制細胞增殖，降低細胞耐藥性，提高療效。本實驗使用流式細胞術和Western blot檢測進一步證實，帕博西尼和他莫昔芬聯(lián)合用藥能夠更加明顯抑制G1期T-47D細胞的生長，且細胞周期相關蛋白cyclin D1和p-Rb蛋白表達明顯降低。

流式細胞術和Western blot檢測結果表明，帕博西尼、他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥均可誘導細胞凋亡，且聯(lián)合用藥細胞凋亡更加明顯。這可能是由于聯(lián)合用藥使T-47D細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低更明顯，促凋亡蛋白Bax和剪切型caspase3蛋白表達明顯升高引起的[15-16]。

腫瘤細胞免疫逃逸是腫瘤細胞在腫瘤微環(huán)境的保護下，可不被機體免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)、識別和殺傷，其在腫瘤增殖、轉移和侵襲過程中具有重要作用[17]。免疫抑制細胞因子如TGF-β1、IL-10、PD-L1等是腫瘤微環(huán)境的主要成分，對腫瘤細胞的增殖和耐藥具有重要影響。MA等[18]研究發(fā)現(xiàn)上調S180實體瘤小鼠模型體內TGF-β1和IL-10水平可促進腫瘤細胞免疫逃逸。李麗煌[19]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者病理組織中PD1/PD-L1 陽性表達率均高于70%，且容易造成腫瘤進展，PD1/PD-L1 陽性患者淋巴結轉移率更高，3年生存率明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，帕博西尼和他莫昔芬單藥均可明顯降低TGF-β1、IL-10和PD-L1水平，但聯(lián)合用藥對免疫抑制細胞因子的下調更加明顯。這提示帕博西尼與他莫昔芬聯(lián)合用藥可協(xié)同減弱乳腺癌細胞免疫逃逸。

綜上所述，帕博西尼與他莫昔芬聯(lián)合用藥可明顯抑制乳腺癌細胞T-47D增殖，促進其凋亡，其機制可能與阻滯細胞周期，下調抗凋亡蛋白表達，上調促凋亡蛋白表達，下調腫瘤免疫抑制細胞因子水平等有關，兩藥聯(lián)合可協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。