針刀干預對膝骨關節炎兔軟骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表達的影響*

張 典 張 茜 許 悅 陳烯琳 秦露雪 郭長青

（北京中醫藥大學，北京 100029）

膝關節骨性關節炎（KOA）是在生物力學和生物學兩者的共同因素相互影響狀態下，引起膝關節周圍結構異常變化和功能慢性退行性改變的骨關節疾病［1］，以疼痛、活動受限為主要臨床表現，以關節軟骨退變為最具標志性病變。正常的關節軟骨不僅無血供來源，且長期處于生理性低氧環境中，KOA發病過程中的軟骨細胞表現為病理性缺氧，且隨著KOA病程進展，軟骨細胞代償性啟動血管生成反而加速軟骨退變。最新研究［2］表明，關節軟骨退變及骨關節炎臨床癥狀的嚴重程度可由軟骨血管化程度反映出來。OA病程早期可見源于軟骨下骨的微血管異常生成，侵入鈣化層軟骨，并可能隨著OA病程繼續發展，骨與軟骨交界處新生血管密度進一步增加［3］，逐步突破潮線侵入非鈣化軟骨層，最終可蔓延至表層軟骨，且骨軟骨交界處血管密度與軟骨退變嚴重程度呈正相關。相關研究發現［4］抑制血管異常生成可有效緩解KOA關節軟骨退變，因此，抑制軟骨新生血管形成可能是治療KOA的新思路［5］。針刀治療KOA療效確切，本項目組前期［6］已經證實針刀通過其力學效應可以發揮對KOA軟骨細胞的保護作用，并在一定程度上可以延緩KOA病理進程。本研究擬立足于觀察針刀干預對KOA兔軟骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表達的影響，以進一步探討針刀治療KOA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

28只健康清潔級，6月齡，雄性，新西蘭兔（倫理編號：BUCM-4-2022010101-1097，動物許可證號：SYXK京2018-0041，北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司），體質量2.0～2.5kg。標準動物飼養籠單籠飼養，標準飼料，自由飲食。保持室溫恒定于（20±2）℃，濕度維持在40%～60%。

1.2 試劑與儀器

EDTA脫鈣液（G1105，Servicebio）；HE染液套裝（G1003，Servicebio）；胃蛋白酶消化液（Servicebio）；PBS緩沖液（G0002，Servicebio）；BSA（G5001，Servicebio）；蘇木素染液（G1004，Servicebio）；一抗CD34（GENETEX-GTX28158-1∶100）；HR-山羊抗大鼠二抗（GB23302-1∶200，Servicebio）；一抗CD105（MA5-17041-1∶500，invitrogen）；一抗 p-h2ax（05-636-I-1∶50，millipore）；HRP山羊抗小鼠二抗（GB23301-1∶200，Servicebio）；ELISA試劑盒（CSB-E08524Rb）；組化試劑盒DAB顯色劑（G1211，Servicebio）。組織攤片機（KDP，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；染色機（Giotto，DIAPATH）；脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司），包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；脫色搖床（TSY-B，Servicebio）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；渦旋混合器（MX-F，Servicebio）；掌上離心機（D1008E，Servicebio）；顯微鏡（XSPC204，CIC）；立式冷藏陳列柜（LSC-316C，星星）；高速組織研磨儀（KZ-II，Servicebio）；臺式高速冷凍離心機（D3024R，大龍）；酶標檢測儀（Epoch，BioTeK）。

1.3 分組方法

實驗動物適應性飼養7 d后，按照隨機分配的基本原則分為空白組、模型組、電針組、針刀組，每組7只。針刀與電針均可通過刺激穴位達到治療效果，但針刀較電針刺激強度更大，在發揮針刺作用基礎上又可通過分解粘連、延長攣縮、減張減壓直接作用于膝周“經筋”，故選取電針組作為陽性對照組，試圖通過實驗結果對比電針與針刀在治療兔KOA的療效差異。

1.4 造模方法

采用改良后Videman［7］左后肢伸直位固定制動法制備KOA模型兔，造模前所有實驗動物均需經嚴格禁食約10～16 h。兔前后肢固定于操作臺，以3%戊巴比妥溶液30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，左后肢腹股溝至足踝關節區域備皮，牽拉左下肢至膝關節完全伸直，以65～85℃熱水充分浸泡樹脂繃帶至軟化后，自腹股溝至足踝固定（保持膝關節完全伸直位180°，踝關節背屈約60°），留出足趾觀察血供，以無色透明膠紙于樹脂外包嚴扎以防兔撕咬。定時觀察兔足趾血供情況及模型脫落情況，及時拆除模具，待恢復正常血運后再次制動。有效制動6周后，確認模型制備成功拆除樹脂固定模具。

1.5 干預方法

各組動物均在拆除樹脂固定后開始進行干預。電針組：固定并選取KOA兔患側梁丘、血海、內膝眼和外膝眼穴進行電針干預治療。取穴參照《實驗針灸學》［8］，并結合動物比較學方法，根據比較解剖取穴法結合模擬骨度取穴法，選取上述腧穴進行治療。采用一次性無菌針灸針，規格0.2 mm×13 mm（環球牌，蘇州針灸用品有限公司）。以韓氏電針儀分別連接“梁丘-血?！薄皟认パ?外膝眼”，選用疏密波，刺激頻率2/100 Hz，強度3 mA，每次干預20 min，隔天1次，共3周。針刀組：固定并以龍膽紫在KOA兔膝關節股內、外側肌腱止點；股直肌肌腱止點；股二頭肌肌腱止點及縫匠肌、股薄肌和半腱肌的聯合腱即鵝足腱；膝關節周圍結節條索狀物進行標記定位。選用漢章系列一次性針刀，規格0.3 mm×30 mm（北京卓越華友醫療器械有限公司）。常規步驟備皮、消毒，隨后刺入針刀，刀刃與肌腱走向平行，刀體垂直于皮膚切面，按照“四步規程”進針刀，每處松解2～3下后出針刀并按壓片刻止血。每周治療1次，共3周。模型組：造模完成后每天1次正常抓取、捆綁固定（方法同干預組）。空白組：不作任何處理，每天正常抓取、捆綁固定（方法同干預組）。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 HE染色 治療結束后，各組動物以3%戊巴比妥溶液麻醉過量致死后立即打開關節腔，在無菌條件下，將直徑為8 mm的環鉆垂直放置于關節軟骨面，在患側膝關節脛骨、股骨軟骨面中央負重區各截取深度為10 mm的軟骨-軟骨下骨復合體圓柱形組織塊。將組織塊放置于4%多聚甲醛充分固定后脫鈣，常規制備石蠟切片、脫蠟、核染色、脫水封片處理。在光鏡下觀察軟骨-軟骨下骨復合體中鈣化軟骨層、非鈣化軟骨層血管分布情況。

1.6.2 免疫組織化學 將軟骨-軟骨下骨復合體組織塊放置于4%多聚甲醛充分固定后脫鈣，常規制備石蠟切片。在完成烤片、修復抗原、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片處理等一系列常規操作后，通過免疫組化染色在光鏡下觀察鈣化軟骨層、非鈣化軟骨層CD34、CD105的表達，其中DAB顯出的蛋白陽性表達呈淺黃色或棕黃色。隨后以Weidner計數法［9］計算微血管密度，先以低倍率（100倍）掃描切片，選擇3個最高血管密度（“熱點”）區域，再以高倍率（200倍）定向掃描3個熱點區域，視野內允許最大數量微血管。由至少2名相對獨立研究者分別對同一切片微血管的數量進行計數，取其平均值作為該切片的微血管密度（MVD），若計數差異超過10%，則需重新計數。

1.6.3 酶聯免疫吸附檢測 獲得關節滑液及血清并置于-80℃冰箱保存，以ELISA試劑盒通過加樣、加檢測抗體、洗板，加酶、顯色和終止反應等一系列常規操作后，檢測滑液及血清中VEGF蛋白表達水平，其濃度由計算出的標準曲線查得。

1.7 統計學處理

應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（）表示。符合正態分布及方差齊的數據資料采用單因素方差分析；不符合正態分布或方差不齊的數據采用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異極具統計學意義。

2 結 果

2.1 各組HE染色結果

在光學顯微鏡下可以觀察到HE染色中：空白組織胞核呈紫藍色，胞質呈粉紅色?？瞻捉M關節軟骨表面光滑平整，細胞層次排列有序，分布及染色均勻，潮線完整，無血管通過，鈣化層軟骨或可見少量血管。模型組關節軟骨表面可見部分剝脫、缺損，細胞分布不均勻，潮線上移且扭曲不規則，有血管通過，并到達非鈣化層軟骨。電針組關節軟骨表層或可見剝脫，細胞分布較均勻，部分出現凋亡，潮線略扭曲、較規則，可見少量血管通過到達非鈣化層軟骨。針刀組軟骨表層較光滑，細胞層次排列均勻，潮線較規則且清晰，偶見重復潮線，偶見少量或無血管穿過到達非鈣化層軟骨。如圖1所示。

圖1 各組軟骨-軟骨下骨復合體組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組免疫組織化學檢測結果

見表1。免疫組化檢驗結果顯示，與空白組相比，模型組MVD值均顯著增加（P＜0.01）；干預后，相比模型組，電針組和針刀組MVD值均明顯降低（P＜0.01），且針刀組顯著低于電針組（P＜0.05）。

表1 各組MVD表達水平比較（±s）

表1 各組MVD表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與電針組比較，△P＜0.05。下同。

組別n CD34CD105空白組模型組電針組針刀組7 7 7 7 0.77±0.34 23.02±2.27*12.19±0.90#8.51±0.61#△0.97±0.48 25.34±2.38*12.31±1.43#7.61±0.75#△

2.3 各組血清及滑液中VEGF表達比較

見表2。與空白組相比，模型組血清及滑液中VEGF表達均明顯升高（P＜0.01）；干預3周后，與模型組相比，電針組與針刀組血清及滑液中VEGF表達水平均有所降低（P＜0.01），且針刀組顯著低于電針組（P＜0.05）。

表2 各組血清、滑液中VEGF表達水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組血清、滑液中VEGF表達水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7血清VEGF 6.50±1.22 14.15±1.11*10.61±0.65#7.61±0.90#△滑液VEGF 6.69±0.85 12.99±1.35*10.27±0.37#8.14±0.47#△

3 討 論

中醫學認為，KOA屬于“骨痹”范疇，“膝者，筋之府也”“筋者，肉之力也”“宗筋主束骨而利機關”，膝關節處筋為全身之最，發揮著包繞、約束骨骼和關節，絡系肌肉皮膚以及維持動態及靜態穩定的功能?，F代解剖學認為，KOA的病理表現“筋傷”是由于膝關節周圍生物力學失衡所導致的一系列病變，針刀松解法是在傳統中醫“經筋”理論指導下，結合現代解剖學理念，通過改善膝關節周圍生物力學環境，恢復膝關節周圍的正常力學平衡，發揮對軟骨細胞的保護作用、延緩關節軟骨退變［10］，以獲得更加持續的治療作用，從而豐富針刀“調筋治骨”內涵。生理條件下，軟骨及軟骨下骨是一個整體的功能單元，軟骨下骨為其分散過度集中的應力。近年多項研究證實，膝關節周圍異常的生物力學環境會直接影響到軟骨下骨病變［11］，使關節軟骨和軟骨下骨過早變性，啟動了骨重塑。Suri等［12］認為，在軟骨下骨重塑過程中，軟骨下骨異常增加的破骨細胞活動使得軟骨下骨板與非鈣化軟骨層之間形成通道，同時裂隙自軟骨表面向下延伸至軟骨下板，被異常的新生血管占據同時深入至軟骨鈣化層。研究表明，軟骨-軟骨下骨復合體組織中的異常血管生成可能激發軟骨內骨化，出現軟骨細胞肥大、X型膠原表達升高［13］等表現，進而加速關節軟骨鈣化及退變。因此可以明確，膝關節周圍異常生物力學環境會啟動骨重塑，骨重塑過程中異常的血管生成又會加速軟骨退變，針刀干預可以通過糾正膝關節周圍力學失衡，減緩骨重塑，緩解異常血管生成，從而發揮軟骨保護作用。

軟骨退變作為KOA的根本病理表現，新生血管異常增生是軟骨破壞的始動環節，缺氧誘導的軟骨血管異常生成是KOA最早出現的病理特征之一，與KOA病程發展密切相關。最新研究［2］支持關節軟骨異常血管生成水平可反映關節軟骨退變及關節炎臨床癥狀的嚴重程度。前期研究已經證實［14］KOA模型兔異常的關節應力環境改變會加速軟骨退變。本課題組已從KOA軟骨細胞凋亡、軟骨細胞增殖、軟骨細胞合成及分解代謝等幾個方面證實了，針刀可以通過其力學效應發揮對KOA軟骨細胞的保護作用。近年研究發現，KOA患者關節軟骨間隙可見骨軟骨連接處存在異常血管生成并延伸至關節軟骨內，同時伴有軟骨細胞退變、軟骨基質鈣化，由此可以明確抑制軟骨中血管生成可以成為治療KOA的新靶點［12，15］。

本實驗通過HE染色觀察到KOA發生時，軟骨細胞代償性啟動血管生成，軟骨下骨微血管侵入鈣化軟骨層，并隨著KOA病程發展，骨與軟骨交界處新生血管密度增加，同時潮線出現重復、結構趨于紊亂甚至消失，部分新生血管逐漸突破潮線，侵入非鈣化軟骨層，最終蔓延至表層軟骨，這與Pesesse等［16］的發現相一致。與此同時，骨軟骨交界處血管密度與軟骨退變嚴重程度直接相關。CD34作為最敏感的血管內皮標志物［16］，其含量變化直接反映了骨關節炎軟骨組織血管的多少；CD105直接參與血管生成，其特異性極好［17］。MVD計數作為標記血管生成的基本方法，MVD標志著血管形成活動效應。本實驗通過免疫組化染色觀察鈣化軟骨層和非鈣化軟骨層CD34、CD105表達，分別計算MVD值發現，模型組、電針組和針刀組MVD值均依次遞減，且針刀干預療效顯著優于電針，差異有統計學意義。因此可以認為針刀干預通過抑制CD34、CD105的表達以達到減少血管重建的效果。

VEGF作為與血管生成關系最密切的細胞因子，可誘導新血管形成［18］，直接參與KOA軟骨血管化，在關節炎發病機制研究中最為廣泛且最具靶向性。除了促進KOA軟骨新血管形成外，VEGF還抑制軟骨中聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原表達加速軟骨基質降解［19］，而軟骨基質最主要的組成成分——聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達減少將導致軟骨退變。Saetan等［20］通過采集并檢測KOA患者的組織液證實，其軟骨中VEGF表達水平顯著升高。本實驗通過酶聯免疫吸附檢測觀察血清及滑液中VEGF的表達，發現KOA兔模型中血清及滑液VEGF表達量均顯著上調，與模型組相比，針刀和電針干預可以顯著減少血清、滑液中VEGF含量，差異有統計學意義，且針刀組VEGF表達水平顯著低于電針組。故可以認為針刀干預是通過抑制血清及滑液中VEGF的表達，從而達到減緩新血管生成的目的。

因此，通過上述實驗結果可以認為針刀干預可以通過“調筋”恢復關節良性應力環境，有效抑制KOA軟骨血管異常生成，發揮軟骨保護作用從而“治骨”。