基于Wnt/β-catenin通路探討通心絡膠囊對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠炎癥水平的影響*

姜雪嬌 李金霞 張秋云△ 宗文靜

（1.首都醫科大學，北京 100069；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700）

動脈粥樣硬化（AS）是多種原因導致的炎癥性血管疾病，其特征是在動脈壁上出現脂質堆積和纖維斑塊，是多種心血管疾病發生的基礎，也是目前世界上導致成人死亡的主要原因之一［1-3］。Wnt通路最早在腫瘤疾病中被發現，但是近年來研究顯示Wnt通路在粥樣硬化性心血管疾病中也有重要作用［1-2］，在AS的發展過程中Wnt信號通路被激活，游離的β-連環蛋白（β-catenin）導致炎癥因子釋放，進而引起血管內皮屏障破壞［3］、血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和細胞外基質礦化（ECM）［4］。

通心絡膠囊是依據中醫絡病理論而制成的中藥復方，前期研究表明通心絡膠囊在治療AS性疾病中起到重要作用［5］，如降低血脂水平，改善患者微炎癥狀態［6］，減少 AS斑塊面積［7］，改善心臟功能和血管舒張，抑制含主動脈斑塊的血管生成［8］，可有效防治AS。然而通心絡膠囊對AS的治療作用是否與Wnt/β-catenin通路有關，目前尚不清楚。在本研究中，我們利用ApoE-/-小鼠建立AS模型，觀察了Wnt/β-catenin通路的相關因子變化及通心絡膠囊的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10周齡ApoE-/-小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養于SPF級實驗動物房，每籠2只，室溫18～23℃，濕度（50.0±2.0）%，每隔12 h開燈照明，自由飲食攝水。本研究嚴格按照國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南中的建議進行。協議得到了首都醫科大學動物倫理委員會批準（批號：AEEI-2020-079），并盡一切努力減少動物的痛苦。

1.2 藥物與試劑

通心絡膠囊膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，國藥準字Z19980015），阿托伐他汀（瑞輝制藥，國藥準字J20030047）。高脂飲食（含膽固醇0.15%、脂肪21%），購自北京科奧協力飼料有限公司。生理鹽水、蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、電泳緩沖液、電轉緩沖液、脫脂專用封閉奶粉、Wnt1抗體（Proteintech，27935-1-AP）、Wnt3a抗體（Abcam，ab219412）、β-catenin抗體（Proteintech，66379-1-Ig）、5×蛋白上樣緩沖液、4%多聚甲醛。

1.3 造模及干預［8-9］

小鼠適應性喂養1周后隨機分為正常組6只（正常飲食，8周后每日給予生理鹽水1 mL/10 g），高脂飲食組18只（高脂飲食）。造模8周后隨機分為模型組6只，高脂飲食，每日給予生理鹽水1 mL/10 g；通心絡膠囊組6只，高脂飲食，每日予通心絡膠囊1.5 g/kg；阿托伐他汀組6只，高脂飲食，每日給予阿托伐他汀4.8 mg/kg。各組均持續灌胃給藥8周。

1.4 標本制備與檢查

1.4.1 主動脈形態學檢查 收集ApoE-/-小鼠主動脈根部，用4%多聚甲醛固定，樣品用OCT包埋，冰凍切片4 μm。然后利用蘇木精和伊紅（HE）、油紅-O染色分析AS斑塊病變。光鏡下觀察主動脈弓組織內膜結構及AS斑塊表現，并在高倍視野下拍照。觀察通心絡膠囊對主動脈結構及斑塊面積的影響。

1.4.2 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白表達 收集各組小鼠的主動脈組織，按照蛋白定量試劑盒的說明檢測蛋白濃度并定量。使用10%SDS聚丙烯凝膠電泳后，在300 mA下將蛋白轉移到0.22 μm PVDF膜中40 min，然后用5%脫脂奶粉密封2 h，入Wnt抗體（1∶1 000）、Wnt3a抗體（1∶1 000）、βcatenin抗體（1∶1 000）孵育過夜。TBST洗滌后，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，以GAPDH作為參考，利用化學成像分析儀進行分析，然后利用Image J進行數據分析。

1.4.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測IL-6、TNF-α含量 收集小鼠血液，4℃過夜后于2～8℃3 000 r/min離心15 min獲取血清，按照試劑盒說明依次進行稀釋、包被、封閉、洗滌等步驟，然后在酶標儀上，于450 nm處以空白為對照孔調零后測各孔OD值，并計算血清中IL-6、TNF-α的水平。

1.4.4 實時熒光定量聚合物酶鏈式反應（RT-PCR）檢測Wnt1、Wnt3a、β-catenin mRNA表達 使用Trizol提取小鼠主動脈中的總RNA，并使用試劑盒反轉成cDNA，利用熒光染料進行擴增，擴增條件為預變性95℃，10 min；熱循環95 ℃，15 s，退火60℃，30 s，共循環40次；溶解曲線，60～95℃，每15秒升溫0.3℃。采用2-ΔΔCT法計算mRNA表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統計學處理

所有數據分析均由GraphPad軟件完成。計量資料以（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊情況觀察

見圖1。與正常組相比較，模型組小鼠血管管腔內斑塊面積增加，脂質沉積明顯，同時內膜下見大量泡沫細胞聚集，脂肪空泡形成，說明高脂飲食可以促進AS的發展，而通心絡膠囊組和阿托伐他汀組可以明顯降低高脂飲食誘導的斑塊面積，內膜增生減輕。

圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部的病理變化（HE、油紅O染色；A、C為50倍，B、D為100倍）

2.2 各組Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白水平比較

見圖2、表1。與正常組相比較，模型組Wnt、Wnt3a、β-catenin的蛋白水平明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比較，通心絡膠囊組與阿托伐他汀組的Wnt、Wnt3a、β-catenin表達量均呈降低趨勢（P＜0.01），其中阿托伐他汀組的β-catenin下降水平不明顯；與阿托伐他汀組相比較，通心絡膠囊組3種蛋白表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達

表1 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達水平比較（±s）

表1 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡膠囊組n 3 3 3 3 Wnt1/GAPDH 1.04±0.16 1.72±0.13*1.07±0.16△△1.02±0.06△△Wnt3a/GAPDH 1.13±0.08 1.75±0.07*1.21±0.14△△1.28±0.10△△β-catenin/GAPDH 1.06±0.12 1.93±0.11*1.44±0.32 1.10±0.09△△

2.3 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較

見表2。與正常組相比較，模型組小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比較，通心絡膠囊組和阿托伐他汀組 Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平明顯降低（P＜0.01），但是通心絡膠囊對Wnt3a的降低趨勢不明顯（P＞0.05）。

表2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較（±s）

表2 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin基因水平表達比較（±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡膠囊組n 3 3 3 3 Wnt1/GAPDH 1.06±0.47 2.24±0.10*1.41±0.19△1.14±0.14△△Wnt3a/GAPDH 0.70±0.06 2.02±0.20*1.22±0.08△1.70±0.11 β-catenin/GAPDH 1.01±0.18 2.78±0.07△△1.28±0.24△△1.23±0.34△△

2.4 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較

見表3。與正常組相比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，阿托伐他汀組和通心絡膠囊組能夠明顯降低TNF-α、IL-6的含量（P＜0.01）。

表3 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6含量比較（pg/mL，±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組通心絡膠囊組n 3 3 3 3 TNF-α 4.34±1.51 16.31±3.69*5.99±0.83△△6.76±0.96△△IL-6 3.53±1.39 10.53±1.37*5.92±2.18△△4.88±1.59△△

3 討 論

AS的特征是彈性動脈內膜的纖維組織和脂質沉積，導致血栓形成和結構損傷，血管壁增厚和硬化［10］。晚期AS斑塊可侵犯動脈腔，阻礙血流，導致組織缺血，同時還可以引發血栓的形成，阻塞管腔，導致缺血的再次發生，甚至危及生命。AS的發病機制比較復雜，其中炎癥是重要的病理基礎。研究顯示炎癥在AS的發展過程中可以促進脂質條紋和纖維斑塊的形成、增加斑塊的不穩定性［11-13］。

Wnt通路由Wnt蛋白家族、細胞膜卷曲受體、共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6、下游轉錄因子（Dvl APC、GSK-3β和TCF/LEF等）及胞質蛋白β-catenin組成［14］。目前研究表明該信號通路在心血管疾病，尤其在AS中起著決定性作用［14-15］。有研究顯示，在AS的發展過程中，該通路可以通過激活炎癥導致內皮功能障礙、促進平滑肌細胞遷移和泡沫細胞形成、促進血管和瓣膜鈣化等途徑推動AS的發展［16］。一項臨床研究發現，人類頸動脈中破裂型斑塊中β-catenin的含量明顯高于穩定型斑塊［17］，此外促炎細胞因子的表達水平明顯上升，表明Wnt/β-catenin信號通路在促炎反應中發揮著重要的作用［18］。

通心絡膠囊是以絡病理論為指導的臨床常用藥物，其主要成分包括人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸棗仁（炒）、冰片。在“絡以通為用”的治療原則指導下，通心絡膠囊被廣泛用于AS性心腦血管疾病。全方以人參為君藥，取其大補元氣、助氣血運行的功效；全蝎、水蛭為臣藥，二者共奏搜風通絡、活血止痙之效，君臣相合使絡脈通暢，氣血運行無阻；蟬蛻與蜈蚣助臣藥搜風止痙，赤芍涼血散血同時可制人參溫熱之性；降香、冰片味辛，能散能走，使絡脈條達，引藥入竅入絡；酸棗仁養血安神；全方具有益氣、活血、通絡止痛作用［19］。在本實驗中，我們通過高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型，以Wnt/β-catenin信號通路和炎癥水平為切入點，探討通心絡膠囊對AS的影響。研究結果顯示，與正常組相比較，模型組小鼠的斑塊面積較大，脂質沉積明顯，內膜增生嚴重，說明在經過高脂喂養后已形成明顯的AS模型。同時模型組小鼠體內Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白和炎癥因子表達增加，說明在AS發展過程中小鼠體內Wnt/β-catenin信號通路被激活，并對相關的炎癥因子進行調控。與模型組相比較，通心絡膠囊組小鼠粥樣硬化斑塊面積明顯下降，泡沫細胞堆積減少，內膜增生減輕，同時Wnt/β-catenin信號通路上關鍵蛋白及炎癥因子表達水平明顯下降。這提示我們通心絡膠囊可能通過Wnt/β-catenin信號通路降低相關炎癥因子的表達，從而抑制動AS的發展。

綜上所述，本研究初步證實通心絡膠囊可以通過抑制Wnt/β-catenin通路降低相關炎癥因子的表達，從而抑制AS的發展。但是由于中藥具有多途徑、多靶點的特性，仍需進一步進行體內外相關機制研究闡明具體機制。