利心水方對大鼠心肌纖維化的影響*

宋曉龍 宋 峻 潘仁友 王 蕾 孫偉新 袁春玲

（1.南京中醫藥大學鹽城附屬醫院，江蘇省鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224000；2.徐州醫科大學，江蘇 徐州 221000）

心血管疾病最終的病理變化最常見的是心肌纖維化，心臟成纖維細胞過度增殖，細胞外基質蛋白過度沉積，心臟間質的重塑是其主要特點［1］。在心臟間質的重塑過程中，心血管病變導致心室大小、結構和形態等發生較明顯的變化，并伴隨著心肌成纖維細胞的異常增殖，膠原的形成增多和降解減少，從而引起膠原蛋白的過度沉積［2］。心肌纖維化的形成導致心肌組織的順應性下降，影響心臟的供血等功能。心肌纖維化與心肌梗死、心衰等心血管疾病密切相關，如不及時治療，會導致心功能不全及休克猝死等，所以對于心肌纖維化的治療是目前的研究重點［3-4］。全國名老中醫曾學文教授在長期臨床實踐中提出心血管疾病的證治規律，即心氣虛-心血瘀-心水腫-心厥脫（簡稱心臟病氣血水厥說）的觀點［5］，臨床經驗證實利心水方對慢性心力衰竭有著顯著的臨床療效。但是利心水方對于治療心力衰竭的內在機制，尤其是對心肌纖維的作用尚不明確。因此，本課題組制備大鼠的心肌纖維化模型，運用利心水方進行體內干預，觀察對心肌纖維化的作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體質量180～220 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2018-0004。實驗均按照實驗動物護理和使用指南進行，經江蘇醫藥職業學院動物實驗倫理委員會批準（XMLL-2021-880）。

1.2 實驗藥物

利心水方：豬苓30 g，人參10 g，白術10 g，黃芪40 g，制附子10 g，玉竹12 g，桂枝10 g，當歸10 g，川芎10 g，葶藶子30 g，澤瀉30 g。加水煎煮兩次，第1次加10倍量水，浸泡1 h，加熱煎煮60 min，過濾；第2次繼續加10倍量水，加熱煎煮40 min，過濾。合并兩次濾液，最終濃縮為生藥含量2 g/mL的藥液。

1.3 試劑及儀器

Trizol（Invitrogen公司，貨號：15596018）；Real Time PCR 試劑盒（諾唯贊公司，貨號：R222-01）；Anti-CollagenⅠ抗體（Abcam公司，貨號：ab34710）；Anti-α-SMA抗體（Abcam公司，貨號：ab32575）；Anti-TGF-β抗體（Abcam公司，貨號：ab92486）；Anti-Fibronectin抗體（Abcam公司，貨號：ab268021）。顯微鏡（OLYMPUS，型號：IX51）；超凈工作臺（蘇州凈化，型號：SWCJ-1D）；qPCR熒光定量系統（杭州博日，型號：FQD-96A）；PCR儀（Eppendorf，型號：6311000070）；紫外分光光度計（ThermoFish，型號：SMA2000）；高速冷凍離心機（DragonLab，型號：LR5K001727）；恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓憧萍?，型號：TU-100）。

1.4 分組與造模

50只SD健康大鼠分為5組：假手術組、模型組和利心水方低劑量組、中劑量組、高劑量組。除假手術組外，剩余4組大鼠均采用縮窄腹主動脈的方法構建慢性心力衰竭（CHF）模型［6］。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，沿肋弓處沿前正中線切開腹部皮膚，長約2.5 cm，繼之打開腹腔分離腹主動脈，平行于腹主動脈放置7號手術針，后用0號絲線繞手術針結扎，取出手術針，確定腹主動脈暢通，最后關腹。假手術組大鼠不結扎腹主動脈只分離。術后第5周末測定大鼠心臟左室舒張末壓（LVEDP），以LVEDP≥15 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）為心肌纖維化模型成功的標準。

1.5 干預方法

利心水方的劑量根據人-鼠劑量的換算公式［大鼠劑量（mg/kg）=W×人劑量（mg/kg），其中W為換算系數6.25］進行選擇［7］。建模成功后，利心水方各劑量組分別以低（5 mL/kg）、中（15 mL/kg）、高劑量（25 mL/kg）的利心水方藥液灌胃，假手術組和模型組予以相同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續喂藥5周。

1.6 觀察指標

1.6.1 超聲心動圖評估大鼠的心臟功能 末次給藥24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，對其進行胸前備皮，調整儀器探頭及調節參數，記錄不同組別大鼠的左室舒張末期內徑（LVEDD）和左室收縮末期內徑（LVESD），并記錄左室短軸縮短率（FS）和射血分數（EF）值。

1.6.2 HE染色 用4%多聚甲醛固定液灌注大鼠，取出心臟，30%蔗糖脫水24 h，OCT包埋，做冰凍切片，厚度10 μm，隨即進行HE染色，鏡下觀察不同組別大鼠的心肌組織變化。

1.6.3 Masson染色 心肌組織按常規包埋、切片，先用蘇木素染核15 min，接著鹽酸酒精分色1～2 s，自來水藍化20 min后麗春紅染色20 min，用雙蒸水快速洗1遍，亮綠染色3～5 s，最后雙蒸水漂洗脫水，脫水后的切片用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.4 RT-qPCR 檢測 CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA的表達 Trizol法提取總RNA，利用核酸蛋白儀檢測RNA濃度和純度。每組各取1 μg RNA進行逆轉錄反應，按試劑盒說明書配制反應體系，42℃ 30 min，95℃ 5 min。以β-actin為內參，利用實時定量PCR儀，采用SYBR染料法進行實時定量PCR反應，基因引物參照GeneBank基因序列設計。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.5 Western blotting法檢測 CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達 提取心肌組織細胞蛋白質，利用二辛可寧酸法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌液洗滌3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌液洗滌3次，化學發光后采集圖像，并用軟件對反應條帶進行灰度分析，各蛋白相對表達量以各蛋白密度單位β-actin密度單位表示。

1.7 統計學處理

應用SPSS25.0統計軟件。計量資料以（）表示。多組間比較以單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心臟彩超結果比較

見表2。與假手術組比較，模型組大鼠LVEDD和LVESD明顯增加，FS和EF數值較假手術組明顯降低（P＜0.01），利用不同劑量的利心水方干預后，大鼠LVEDD和LVESD較模型組顯著下降，隨著劑量升高，差異越顯著，而利心水方組大鼠FS和EF較模型組顯著升高，同樣，隨著劑量升高，差異越顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠心臟彩超結果比較（±s）

表2 各組大鼠心臟彩超結果比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與低劑量組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。下同。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 EF（%）86.29±2.74 37.92±2.59**45.39±2.95#55.11±2.87##$$68.88±1.59##$$FS（%）57.34±2.04 18.96±2.14**25.43±1.92#35.49±1.72##$$42.52±2.43##$$LVEDD（mm）4.97±0.22 8.87±0.27**7.87±0.26##7.10±0.13##$6.21±0.22##$$LVESD（mm）2.24±0.30 4.51±0.27**4.03±0.15 3.31±0.20##$2.86±0.17##$$

2.2 各組大鼠心肌組織的病理變化

HE染色示：假手術組大鼠的心肌細胞排列整齊，生長均一，細胞間隙小，而模型組大鼠的心肌細胞排列紊亂，細胞變大，間隙也明顯增大，同時可見比較明顯的心肌纖維化病灶的形成。與模型組相比，利心水方組大鼠的心肌細胞排列較為整齊，細胞間隙較小。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織的病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠心肌膠原表達比較

Masson染色示：假手術組中大鼠的心肌細胞及其周圍未發現明顯膠原纖維沉積；而模型組大鼠心肌細胞和血管周圍能觀察到大量藍色的膠原纖維的沉積；與模型組的大鼠心肌組織相比，利心水方各組大鼠的心肌細胞膠原纖維的沉積顯著減少，高劑量組心肌細胞只有少量膠原纖維沉積。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌膠原表達（Masson染色，200倍）

2.4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達比較

見表3。與假手術組的大鼠相比，模型組大鼠心肌組織的Collagen I、α-SMA、TGF-β、FibronectinmRNA的表達水平顯著升高（P＜0.01），利心水方組干預后，與模型組相比，心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達比較（±s）

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 Collagen I 1.00±0.06 2.15±0.06**1.71±0.09##1.38±0.07##$$1.11±0.07##$$α-SMA 1.00±0.07 3.10±0.09**2.43±0.11##2.12±0.09##$1.64±0.08##$$TGF-β 1.00±0.07 2.85±0.13**2.29±0.15##2.09±0.08##1.53±0.06##$$Fibronectin 1.00±0.10 3.22±0.09**2.64±0.08##2.39±0.09##$1.85±0.08##$$

2.5 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達比較

見表4、圖3。與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），利心水方組干預后，心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的蛋白水平表達顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 CollagenⅠ1.00±0.21 4.20±0.33**3.27±0.30##2.47±0.27##$1.55±0.09##$$α-SMA 1.00±0.14 4.58±0.33**3.54±0.21#2.84±0.45##2.03±0.30##$$TGF-β 1.00±0.07 4.18±0.29**3.47±0.25#2.68±0.21##$2.07±0.26##$$Fibronectin 1.00±0.13 4.52±0.40**3.58±0.20##2.79±0.16##$2.15±0.32##$$

圖3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白條帶

3 討 論

心肌纖維化是心臟受到多種病理因素影響所致，心肌成纖維化細胞過度增殖，細胞外基質膠原蛋白等過度沉積，進一步形成心肌纖維化，影響心臟功能［8］。有文獻研究表明，心肌細胞受損時，缺少血氧，血液動力超負荷，促發心肌及間質細胞的相關基因表達，分泌多種活性細胞因子和生長因子，通過自分泌、旁分泌、血液循環、信號轉導等作用，誘導心肌成纖維細胞活化增殖。臨床上關于心肌纖維化的具體途徑和機制尚不清楚，但已有研究報道，TGF-β1、氧化應激、炎癥因子等參與了心肌纖維化的發生［9-10］。目前對中藥復方治療心肌纖維化的臨床作用受到重視，本團隊臨床研究表明，利心水方Ⅱ能夠明顯改善慢性心力衰竭患者心功能狀態，對改善心室重構有重要作用［11］。另外，筆者先前研究發現利心水方可以改善冠心病心力衰竭患者的臨床癥狀和心功能，并對心肌纖維化有一定作用，能改善心肌重構［12］。利心水方對于心肌纖維的作用機制尚不完全明確。因此，本課題組利用大鼠的心肌纖維化模型研究利心水方體內干預下對心肌纖維化的作用，為臨床用藥提供基礎研究。

與之前研究結果相似，超聲心動圖檢測發現利心水方可顯著改善心臟功能。HE染色和Masson染色實驗結果表明，利心水方組中大鼠心肌細胞排列更為整齊，細胞間隙也較小，心肌細胞膠原纖維的沉積顯著減少。由此可見，中藥復方利心水方對于大鼠的心肌纖維化具有一定的保護作用，可在一定程度上減少膠原的沉積。與模型組相比，利心水方干預組心肌組織有一定程度的恢復。利心水方由人參、黃芪、玉竹、桂枝、制附子、當歸、川芎、白術、葶藶子、豬苓、澤瀉等組成，具有益氣溫陽、化瘀行水的功效。有研究發現運用溫陽化飲、益氣活血法干預急性心肌梗死早期左室重構大鼠，其血清腎素、AngⅡ、ALD含量明顯下降，證實中藥通過抑制RAAS激活降低心肌纖維化程度［13］，這與筆者的研究結果相似。

心臟成纖維細胞不僅可以分泌細胞外基質，也可以發揮降解細胞外基質的作用，從而保持正常心臟功能所必需的細胞外基質的平衡［14］。在疾病狀態下，各種刺激損傷因素（如炎癥細胞浸潤、細胞因子、缺氧及高血糖等）均能誘導成纖維細胞活化增殖，轉化為肌成纖維細胞，其高表達α-SMA。肌成纖維細胞會分泌大量細胞外基質波形蛋白、纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原等［15-16］。TGF-β/Smad信號通路是調節細胞外基質產生和心肌組織纖維化的關鍵信號通路［17］。在其他臟器的纖維化（肺纖維化和肝纖維化）中，均可見相關信號通路的活化，表明TGF-β在組織器官的纖維化中發揮著重要作用［18-21］。

本研究通過RT-qPCR和Western blotting實驗檢測了各組CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的表達用以研究利心水方對心肌纖維化的作用。結果表明,心肌組織中CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，進一步證實了利心水方對心肌纖維化具有保護作用。綜上所述，中藥復方利心水方對于大鼠的心肌纖維化有一定的保護作用。