乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染、毒性及轉化研究進展

王瑞虎，李萌萌，關二旗，劉遠曉，金 瑞，卞 科，趙世通

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）俗稱嘔吐毒素，是禾谷鐮刀菌等真菌在一定的溫度、濕度條件下產生的次級代謝產物，常存在于小麥、玉米和大麥等谷物及其制品中，并通過食物鏈在人和動物體內蓄積，具有廣泛的生殖毒性、發育毒性、細胞毒性、免疫毒性和神經毒性等[1]。隨著對DON研究的深入，DON衍生物也逐漸成為關注的重點。目前已發現的DON衍生物主要包括3-乙酰基-DON（acetyl-DON，3-Ac-DON）、15-乙酰基-DON（15-acetyl-DON，15-Ac-DON）、DON-3-葡萄糖苷（DON-3-glucoside，DON-3-G）、DON-15-葡萄糖苷（DON-15-glucoside，DON-15-G）、DON-3-葡萄糖苷酸（glucoside acid，GlcA）、DON-15-GlcA、去環氧DON（deepoxy-DON，DOM）、3-酮基-DON（3-ketone-DON，3-keto-DON）和3-異構-DON（3-epimerization-DON，3-epi-DON）等[2-4]。

其中，3-Ac-DON和15-Ac-DON均為DON的生物合成前體，由共同前體3,15-二乙酰DON（3,15-diacetyl-DON，3,15-diADON）產生，3-Ac-DON和15-Ac-DON往往伴隨DON產生，三者分子結構如圖1所示。3-Ac-DON和15-Ac-DON的毒性與DON相似，在一些細胞中的毒性甚至比DON更強，且大部分在人和動物體內會重新轉化生成DON，具有較高的生物利用率和轉化率，嚴重威脅人和動物健康[4]。2011年，聯合國糧農組織和世界衛生組織下屬的食品添加劑聯合專家委員會（Joint Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization Expert Committee on Food Additives，JECFA）規定該類化合物（上述3 種毒素）的臨時最大每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為1 μg/（kgmbg d）[5]。因此，在廣泛研究DON毒性及降解規律時，關注3-Ac-DON和15-Ac-DON的毒性及其轉化尤為重要。本文主要介紹DON乙酰化衍生物的產生、檢測技術、污染現狀及風險評估研究進展，重點綜述DON乙酰化衍生物的細胞毒性、基因毒性和聯合毒性等，同時闡述3 種毒素在各消化階段及加工過程中的轉化情況，以期為DON乙酰化衍生物的降解和防控研究提供參考。

圖1 DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的分子結構Fig.1 Molecular structures of DON,3-Ac-DON and 15-Ac-DON

1 乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的生成

3-Ac-DON和15-Ac-DON的生成與禾谷鐮刀菌等真菌產毒的途徑有關。參與毒素生物合成的基因共有12～16 個，不同菌株參與的基因有所差異[6-7]。這些基因被統一命名為Tri基因，其中Tri3～Tri14共12 個基因組成Tri5基因簇，Tri1與Tri16兩個基因組成一個基因簇，Tri15與Tri101基因游離于這兩個基因簇之外[8]。3-Ac-DON和15-Ac-DON由Tri8基因催化其前體物質3,15-diADON水解生成，之后脫乙酰基生成DON，是DON生物合成的關鍵步驟。不同鐮刀菌的Tri8基因略有不同，基因表達的不同顯著影響了兩種毒素的含量與分布[9]。

溫度顯著影響3-Ac-DON和15-Ac-DON的生物合成，產生DON和3-Ac-DON的最佳溫度在25～30 ℃之間，產生15-Ac-DON的最佳溫度較低，約10 ℃[10]。同時，地理位置與采樣年份的不同會顯著影響菌株類型，從而影響兩種毒素的分布狀況[11]。由于3-Ac-DON和15-Ac-DON是產生DON的前體物質，當鐮刀菌產生DON時，3-Ac-DON和15-Ac-DON往往伴隨DON的產生而產生，受環境、地區等的影響，保留程度各不相同。亦有研究發現，產生3-Ac-DON的鐮刀菌對全球環境變化表現出更強的適應性，正在成為主要的產毒鐮刀菌[12-13]。研究掌握兩者的產生途徑及影響因素，明確產生毒素的化學型，對DON及其乙酰化衍生物的防控具有至關重要的作用。

2 3-Ac-DON和15-Ac-DON的檢測、污染現狀及風險評估

2.1 3-Ac-DON和15-Ac-DON的檢測

3-Ac-DON和15-Ac-DON檢測的研究難點在于如何進一步經濟、迅速地分離純化得到相應標準品[14]。常用的檢測方法主要是氣相色譜串聯質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜串聯質譜法（liquid chromatographyt and emmassspectrometry，L C-M S/M S）。由于3-Ac-DON和15-Ac-DON是同分異構體，采用HPLC檢測干擾較多，定性效果較差，GC-MS/MS需要采用衍生的方法，過程較繁瑣。因此，3-Ac-DON和15-Ac-DON的檢測主要采用具有較高分離能力和抗干擾能力、快速、重現性強的LC-MS/MS，運用特征性碎片離子實現對兩種毒素的同時檢測。

Cao Meirong等[15]開發了一種自動在線固相提取系統，結合LC-MS/MS對玉米和小麥樣品中3 種毒素進行測定。將樣品的提取溶劑注入自動在線固相提取系統，以減少基質干擾。檢測限為0.1～0.2 μg/kg，回收率在86.5%～99.7%之間。自動化在線固相提取系統能夠直接將提取物注入LC-MS/MS中，加快分析速度，提高分析效率。超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是在LC-MS/MS基礎上進一步提高分析速率和分離效率的技術，龔蕾等[16]運用UPLC-MS/MS在10 min內實現了對DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON和DON-3-G的快速分離鑒別，樣品前處理回收率88.5%～117.0%，相對標準偏差為1.5%～8.6%，極大地提高了檢測效率。

2.2 DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的污染現狀及風險評估

受氣候變化、耕作制度改變等因素的影響，DON及其乙酰化衍生物在世界范圍內的檢出率越來越高，而且DON及其乙酰化衍生物共存的現象普遍存在。產生3-Ac-DON的鐮刀菌具有較強的產孢子能力、生長速率和適應性，對谷物危害嚴重[12-13]。即使原始樣品中不含3-Ac-DON和15-Ac-DON，在長期儲藏后的樣品中，二者仍可能產生[17]。近年來國內外學者對DON及其乙酰化衍生物污染情況的調查結果如表1所示。

表1 食品及原料中DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON污染現狀Table 1 Contamination status of DON,3-Ac-DON and 15-Ac-DON in foods and raw materials

續表1

研究發現，由于自然界產毒真菌的廣泛存在，DON及其乙酰化衍生物的污染不僅存在于谷物及其制品中，木薯、山藥等作物中也有檢出，對食品安全構成極大威脅。同時，不同年份樣品中3 種毒素污染率普遍較高，而小麥等谷物儲藏周期往往較長，儲藏期間毒素的變化將進一步增加食品安全風險[17]。DON及其乙酰化衍生物主要經過食物鏈在人體內蓄積，這3 種毒素的暴露具有同時發生、高毒性、高污染等特點，在進行污染情況調查以及評估真菌毒素飲食暴露量時，往往需要將3 種毒素累積風險同時評估。

雖然對多數食品的評估結果顯示，DON及其乙酰化衍生物的估計每日攝入量均低于JECFA規定的ADI[32-34]，但個別毒素含量較高的食品仍可能帶來較大安全隱患。Han Zheng等[35]研究發現，對DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON三者綜合考慮計算累積健康風險，5%的人群毒素攝入量高于1.087 μg/（kgmbg d），具有潛在的健康威脅。在環境適宜產毒真菌生長的部分地區3 種毒素飲食暴露值甚至高達2.39 μg/（kgmbg d）[36]。因此，有必要對DON及其乙酰化衍生物進行更深入的風險評估，積極建立健全DON及其乙酰化衍生物的農業防控、污染預測、污染監測、執行立法等風險管理措施，以保障糧食安全，減少食品安全問題的出現。

3 3-Ac-DON、15-Ac-DON的毒性及轉化

DON會對人和動物產生廣泛的毒性效應，如細胞毒性、基因毒性、免疫毒性、生殖毒性等，包括神經內分泌信號通路改變、促炎癥基因表達、生長激素軸破壞和腸道完整性改變等毒性反應[37-38]，產生嘔吐、腹瀉、惡心、頭昏等癥狀[1,39]。研究發現，DON的乙酰化引起其結構變化并產生了毒性差異，相較而言，3-Ac-DON和15-Ac-DON的毒性與DON相似，在一些細胞中甚至比DON更強[40-41]。同時，3-Ac-DON和15-Ac-DON的極性較強，更有利于擴散，這極大地增加了兩種乙酰化衍生物的毒性作用[3]。DON乙酰化衍生物與DON表現出較強的聯合毒性作用[42]，大部分3-Ac-DON和15-Ac-DON在加工與消化過程中會被轉化為DON[43-45]，嚴重危害食品安全。

3.1 3-Ac-DON、15-Ac-DON的毒性

3.1.1 細胞毒性

DON乙酰化衍生物具有較強的細胞毒性，對多數細胞具有損傷作用，可以改變細胞滲透性、細胞膜完整性，抑制跨上皮轉運、細胞內因子分泌，影響細胞內部調節因子表達、細胞增殖和活力，并最終導致細胞膜裂解、細胞死亡[46]。研究評估DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON對人體腸細胞滲透性的影響，結果顯示，15-Ac-DON的滲透性最高，誘導細胞電阻下降最高，并促使其表現出顯著的熒光黃滲透性，影響細胞膜屏障功能[46-47]。在分化細胞中，15-Ac-DON亦顯著影響細胞的屏障功能[48]。在分子水平上，3 種毒素顯著影響細胞內調節細胞增殖、代謝過程效應因子細胞有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK)、細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）、p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的產生，引起線粒體氧化應激反應、線粒體呼吸中斷，引發細胞能量代謝障礙，蛋白質磷酸化，導致細胞凋亡。而15-Ac-DON可以更顯著地影響MAPK、ERK1/2的表達，因此15-Ac-DON毒性更大，造成的組織學病變比DON與3-Ac-DON更強[49]。同時，3 種毒素會刺激細胞中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細胞介素（interleukin，IL）-1β的分泌，導致厭食癥的發生[50]。

受3 種毒素影響，細胞的增殖與活力也會顯著下降，評估細胞在體外生長與存活能力降低50%時的濃度（半抑制劑量）可以較好地表征各種毒素的細胞毒性。在馬的免疫細胞中，DON和3-Ac-DON的半抑制質量濃度分別為3.09、25.90 μg/mL，而在增殖細胞中，DON和3-Ac-DON的半抑制質量濃度分別為0.73 μg/mL和6.89 μg/mL[51]，毒素對馬增殖細胞的影響比一般細胞更顯著。Juan-García等[41]研究認為，3-Ac-DON對人體肝細胞的毒性比15-Ac-DON更大，采用噻唑藍法測定二者在一定時間內的半抑制質量濃度分別為3.6～6.2、5.2～8.1 μg/mL，在中性紅實驗中3-Ac-DON也表現出最強的毒性作用[52]，顯著地影響人體肝臟功能，毒素隨作用時間延長對肝細胞的毒性逐漸增強。與多數研究不同，在肝細胞中3-Ac-DON表現出更高的毒性，這可能與實驗采用的細胞體系與研究方法有關，毒素對不同生物細胞與同種生物不同細胞的毒性，需要進一步探討，以明確3 種毒素對各種細胞毒性的不同及其毒性機制。

3.1.2 基因毒性

3-Ac-DON和15-Ac-DON顯著影響基因表達，誘導DNA損傷并導致基因表達差異，促使凋亡基因表達，引起細胞周期停止和DNA合成抑制，從而抑制蛋白質合成，導致細胞凋亡。DON乙酰化衍生物即使在低濃度的情況下也會造成DNA損傷[53]。小鼠經口攝入DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON后，體內血清TNF-α、IL-1β、IL-6、CXC趨化因子配體2、血漿炎性趨化因子CC配體（chemokine C-C motif ligand，CCL）-2和CCL-7mRNA等出現顯著上調[54]，引起急性毒性。Pinton等[46]通過DNA芯片篩選毒素對腸細胞基因表達的影響，DON和15-Ac-DON誘導最顯著的基因是炎癥趨化因子IL-8基因，酶聯免疫吸附試驗檢測結果顯示，不同毒素刺激IL-8產生的能力依次為3-Ac-DON＜DON＜15-Ac-DON。這些炎癥因子將導致慢性炎癥性疾病，并加重人體對某些食物過敏原的過敏反應[55]。

3-Ac-DON和15-Ac-DON除誘導病原性基因的表達外，亦會抑制細胞內DNA合成，影響細胞生長代謝等過程，甚至導致細胞凋亡[56-57]。采用溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法測定DON乙酰化衍生物對細胞DNA合成的影響，發現15-Ac-DON顯著抑制細胞內DNA合成[56]。采用酵母細胞進行毒性評價發現，15-Ac-DON對線粒體核糖體基因的具有顯著抑制作用，15-Ac-DON處理對葡萄糖轉運基因HXT9和HXT11的影響明顯高于其他霉菌毒素，細胞出現明顯的葡萄糖缺乏現象，引起細胞凋亡，DON和3-Ac-DON暴露影響與15-Ac-DON相似但相對變化較小[57]。研究表明，DON乙酰化衍生物具有較強的基因毒性，影響細胞內基因表達，但DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON化學結構的差異導致了與細胞死亡和細胞周期異常相關的基因表達的變化[58]，15-Ac-DON的基因毒性顯著高于DON。

3.1.3 聯合毒性

多數情況下，真菌毒素污染往往不是單獨發生的，人和動物常同時暴露于幾種霉菌毒素，其毒性存在協同、增效或拮抗等多種效應，真菌毒素混合物的毒性不能僅根據單個化合物的影響來預測[59]。

在低濃度下，單端孢霉烯族毒素間具有協同作用；在較高濃度組合下，具有相加或近乎相加的作用[42]。研究發現，不同濃度處理人體胃上皮細胞24 h，DON在低和中等抑制濃度水平下與15-Ac-DON具有協同細胞毒性，能夠顯著降低細胞活性[60]；DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON二元或三元作用于小鼠腹腔巨噬細胞的聯合毒性作用均表現為協同作用，毒素聯合作用于細胞后顯著提高了細胞活性氧濃度和細胞線粒體膜通透性[61]；在肝細胞中DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON顯著影響細胞發育，抑制細胞增殖，亦主要表現為協同作用[62]。DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON含量較低時，單獨暴露于每種毒素可能不會產生風險，但當暴露于混合毒素時，可能會超過毒性效應的閾值劑量。應對3 種真菌毒素混合物的毒性及其在動物實驗中的相互作用進一步研究，加強對3-Ac-DON和15-Ac-DON的監測控制[61-62]。

如表2所示，15-Ac-DON表現出更強的基因毒性，在影響細胞滲透性、完整性以及細胞增殖、生長等方面，3-Ac-DON和15-Ac-DON表現出與DON相似毒性，在針對不同細胞體系的研究中，3 種毒素毒性的表現略有差別，說明兩種乙酰化毒素對不同細胞、組織等的毒性仍需進一步研究闡明[47,57]。同時，3 種毒素表現出較強的聯合毒性作用[61-62]，而谷物食品大都被DON及其乙酰化衍生物共同污染[24]，在制定相關限量標準、評估真菌毒素污染狀況及風險預警時，應充分考慮3-Ac-DON、15-Ac-DON的毒性[41,47]。

表2 DON及其乙酰化衍生物毒性分析Table 2 Toxicity of DON and its acetylated forms

3.2 3-Ac-DON和15-Ac-DON的生物轉化

人和動物攝入真菌毒素后，消化系統、腸道微生物群會代謝這些真菌毒素，將其轉化為不同的活性形式[63-64]。去乙酰化是3-Ac-DON和15-Ac-DON在人和動物體內的主要代謝途徑[43-44]。

研究表明，豬體內3-Ac-DON在吸收之前迅速發生去乙酰化生成DON，喂食后20 min即在血漿中檢測到DON，3 h后血漿中DON達到最大濃度[65]。豬口服DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的吸收率均為100%，3-Ac-DON和15-Ac-DON完全水解。對于肉雞，DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON經口攝入后吸收率分別為10.6%、18.2%和42.2%，在肉雞體內3-Ac-DON完全水解為DON，而15-Ac-DON水解的比例較低（75.4%）[66-67]。雖然研究中15-Ac-DON水解相對較少，但15-Ac-DON毒性在多數細胞中與DON相似甚至更強，因此就全身毒性而言，兩種乙酰化衍生物都可以近似被認為是DON本身的毒性。

采用動物糞便厭氧微生物體外培養3-Ac-DON和15-Ac-DON，在大鼠、豬和人類估計的腸道停留時間內，3-Ac-DON和15-Ac-DON都可以通過腸道糞便微生物群完全轉化為DON，3-Ac-DON和15-Ac-DON在腸道內轉化為DON的時間占停留時間的比率如表3所示，在人體內，兩種乙酰化衍生物有充足時間轉化為DON，構成健康威脅[44]。

表3 3-Ac-DON和15-Ac-DON在腸道內轉化為DON的時間占停留時間的比率Table 3 Ratio of transformation time of 3-Ac-DON and 15-Ac-DON to DON in intestinal tract to residence time

研究人員通過體外實驗研究人體消化酶與消化系統微生物對3-Ac-DON和15-Ac-DON的去乙酰化作用，發現小腸與肝臟具有較強的去乙酰化能力，而結腸和腎臟作用則較弱，胃蛋白酶、胰酶、腸道細菌均具有一定的去乙酰化能力，3-Ac-DON和15-Ac-DON在人體內去乙酰化過程如圖2所示[68]。胃腸道是人和動物對抗食物污染物的第一道屏障，3-Ac-DON和15-Ac-DON在消化系統轉化為DON后，機體迅速吸收DON，同時DON及其代謝物快速分布于血漿、肌肉、胃、腸、肝、腎、心臟、腦和脾等組織[69]。在肉雞、豬、大鼠、小鼠、人類、人類組織與細胞中，3-Ac-DON和15-Ac-DON均表現出較強的去乙酰化能力，即使不考慮吸收后3-Ac-DON和15-Ac-DON與DON具有相似甚至更強的毒性，3-Ac-DON和15-Ac-DON在機體消化、代謝、排泄進程及體內微生物作用下也會迅速轉化為DON，危害人與動物的健康。

圖2 人體3-Ac-DON、15-Ac-DON去乙酰化過程Fig.2 Deacetylation process of 3-Ac-DON and 15-Ac-DON in human body

3.3 加工過程3-Ac-DON、15-Ac-DON的轉化

食品在制作過程中大多經過儲藏、清理和加工等過程，這些過程都會影響DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON在食品中的含量與分布。加工過程DON含量上升可能與其隱蔽型轉化有關[70-71]。在啤酒釀造過程中，DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON含量均出現顯著下降，D3G含量上升，這可能與酵母的生長代謝有關[72]。而研究饅頭制作過程中pH值、酵母菌水平和蒸制時間對3-Ac-DON、15-Ac-DON轉變為DON的影響時發現，堿性條件和較短的蒸制時間有利于毒素的去乙酰化，饅頭加工完成后DON含量顯著升高[45]。面包制作時，發酵過程3-Ac-DON和15-Ac-DON含量顯著降低，在和面階段，3-Ac-DON和15-Ac-DON含量進一步下降，DON含量上升，3 種毒素之間可能發生了轉化[68]。在另一項研究中，面包制作過程中，3 種毒素含量均出現顯著下降[73]。這可能由于溫度、發酵過程中使用的酵母菌株、烘烤時間、面包大小等均會影響面包的制作過程，并會影響真菌毒素的穩定性，從而造成了毒素不同的變化趨勢。

小麥粉中蛋白質可能導致了3-Ac-DON和15-Ac-DON的去乙酰化[74]，如細胞色素P450、乙酰酯酶和組蛋白脫乙酰化酶是面團制備中去乙酰化的潛在作用酶。而堿性條件、和面過程與高溫過程可能加速了這些蛋白作用的進程，而因食品中這些蛋白的廣泛存在，食品加工過程中DON乙酰化衍生物將不可避免地轉化為DON。目前關于3 種毒素在食品加工過程相關轉化及作用機制的研究尚不完善，毒素之間的相互轉化顯著影響了它們帶來的健康風險，需要進一步研究這些過程加以闡明。

4 結語

DON的產生往往伴隨其乙酰化衍生物的產生，且在世界范圍內污染率呈逐漸升高的趨勢，產生3-Ac-DON的鐮刀菌具有更強的環境適應性，正在成為主要的產毒鐮刀菌，需進一步調查評估其影響。而DON乙酰化衍生物的毒性與DON相似，在一些細胞體系中甚至比DON更強，產生廣泛的細胞毒性、基因毒性等，影響細胞內蛋白質合成、基因表達、DNA合成，產生較強的氧化應激反應，促使細胞凋亡，并與DON具有較強的協同毒性。同時，在人和動物體內，絕大多數DON乙酰化衍生物會迅速轉化為DON。因此，在風險評估中應綜合考慮DON及其乙酰化衍生物的毒性，同時應對其相互轉化后毒性的變化做進一步評估。

關于DON乙酰化衍生物的毒性及在食品加工、儲藏等過程的轉化機制仍有待完善，為了保障食品安全，仍需對DON乙酰化衍生物在不同細胞、組織體系中的毒性和不同過程的轉化進行深入研究，應進一步優化改進檢測技術，并制定相關限量標準，以降低食品安全風險；研究DON降解技術的同時，關注其乙酰化衍生物的降解情況，從而全面評估降解技術的應用效果。