沉香暴食害蟲黃野螟性信息素分泌源EAG和GC-MS分析

蘇浩然，王同飛，文 平*，王 剛，莊翔麟

(1.西南林業(yè)大學(xué)/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650051；2.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南勐臘 666303)

昆蟲通過雌、雄個體間釋放與接收信息素來進(jìn)行繁殖行為[1]。鱗翅目螟蛾總科成蟲的性信息素腺體發(fā)達(dá)，在雌、雄個體間存在多種信息素來源腺體[2]。研究發(fā)現(xiàn)，螟蛾總科成蟲的信息素腺體主要分布于雌蟲腹部末端的腹節(jié)節(jié)間膜和雄蟲翅腺上。如豆野螟(MarucatestulalisGeyer)[3]、麻楝蛀斑螟(Hypsipylarobusta)[4]以及竹織葉野螟(AlgedoniacoclesalisWalker)[5]的信息素分泌腺存在于腹部末節(jié)第8節(jié)與第9節(jié)的腹節(jié)節(jié)間膜上。煙草粉斑螟(Ephestiaelutella)[6-7]、印度谷螟(Plodiainterpunctella)[8]雄蛾的信息素腺體存在于其翅腺上。在對昆蟲信息素的研究中，確認(rèn)信息素釋放腺體位置成為準(zhǔn)確鑒定信息素重要前提基礎(chǔ)。

沉香屬(Aquilaria)植物是中藥沉香的來源[9-10]，為我國南方的重要經(jīng)濟(jì)林木樹種。黃野螟(HeortiavitessoidesMoore)是土沉香(A.sinensis)等重要沉香種植園栽培苗木上的主要暴食性害蟲。危害時常將沉香葉片啃食至僅剩葉脈，啃食完葉片后還會取食沉香小枝表皮，這直接影響了沉香生長，導(dǎo)致沉香結(jié)香量下降；甚至，防治不及時，經(jīng)過2～3次暴食危害后，沉香苗木常成片呈火燒狀枯死[11-12]，造成經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境影響。要保護(hù)土沉香健康生長就必須對黃野螟進(jìn)行有效防治。化學(xué)防治是目前防治黃野螟的主要手段[13]，但因抗藥性導(dǎo)致的用藥過量又會影響藥用沉香的農(nóng)殘水平和結(jié)香品質(zhì)，同時殺傷黃野螟的天敵，并對環(huán)境造成污染[14]。因此迫切需要研究、開發(fā)黃野螟的綠色防控技術(shù)，其中性信息素具有較好應(yīng)用前景[15]。使用性信息素對害蟲進(jìn)行防治具有高效綠色的優(yōu)點(diǎn)，需要通過逐步鑒定來確認(rèn)性信息素關(guān)鍵組分結(jié)構(gòu)和比例后進(jìn)行開發(fā)，而首先需要確認(rèn)的是性信息素的產(chǎn)生或釋放的部位。黃野螟的性信息素已經(jīng)得到了關(guān)注，按照文獻(xiàn)報(bào)道的常見螟蛾科性信息素腺體部位[2]，研究者以黃野螟雌蛾腹部第8節(jié)與第9節(jié)的性腺為其性信息素提取部位進(jìn)行提取[16-17]，在黃野螟羽化高蜂期使用多頭處女雌蛾的性腺提取物進(jìn)行林間引誘，誘蛾量在幾十只每天。但根據(jù)黃野螟的產(chǎn)卵量和暴發(fā)特性，林間成蛾數(shù)量可達(dá)成百上千，說明重捕率有限[18]。此外，直接使用腺體提取物進(jìn)行檢測中，從圖譜上看，并沒有發(fā)現(xiàn)很明顯的性信息素主要成分[16]。所以推測黃野螟雌蛾腹末的第8、第9節(jié)并不是其分泌和釋放信息素的主要部位，因此很有必要對其他可能釋放性信息素的蟲體部位進(jìn)行細(xì)致的檢測確認(rèn)。

筆者以黃野螟為研究對象，將處于暗周期下的黃野螟雌蛾各部位進(jìn)行分段解剖，放入滴管內(nèi)制成味源管后，使用昆蟲觸角電生理系統(tǒng)(electroantennogram,EAG)分別檢測對比雌蛾各部位分段氣味對黃野螟雄蛾EAG響應(yīng)，并與文獻(xiàn)中所用的雌蛾腹部第8～9節(jié)提取物氣味功能進(jìn)行對比，以鑒定黃野螟雌蛾分泌氣味對雄蛾產(chǎn)生特異性EAG活性成分的部位。隨后使用固相微萃取頂空(solid phase microextraction,HP-SPME)對能產(chǎn)生強(qiáng)EAG響應(yīng)的部位進(jìn)行揮發(fā)物提取，并使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)對所提揮發(fā)物進(jìn)行離子流分析，以判定黃野螟雌蛾性信息素分泌腺體所在部位，從而為黃野螟性信息素準(zhǔn)確鑒定提供腺體組織定位的工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx供試黃野螟均采自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，在沉香苗圃中調(diào)查蟲害后將帶有卵塊的沉香葉片采集并放入塑料盒(長14.0 cm、寬8.0 cm、高6.0 cm)內(nèi)，在盒蓋上開若干小孔以保持空氣流通。卵表面變?yōu)樯铧S并帶有黑點(diǎn)時，在卵上方放置一片健康的沉香頂部嫩葉，以保證幼蟲孵化后有充足的食物。1～3齡幼蟲每100頭左右放置到一盒中，每日提供3 ～ 5片沉香嫩葉。3～5齡幼蟲需每20頭放置到一盒內(nèi)飼養(yǎng)，每日提供10～20片成熟沉香葉片并清除盒內(nèi)糞便，防止黃野螟染病死亡。將5齡以后、體表變?yōu)辄S色且不繼續(xù)取食葉片的黃野螟幼蟲15頭一盒放入化蛹盒內(nèi)(化蛹盒為長14.0 cm、寬8.0 cm、高6.0 cm的塑料盒，在塑料盒內(nèi)添加2.0 cm厚的江沙土，并使用去離子水保持盒內(nèi)濕度50%。江沙土需先過10目篩，取細(xì)顆粒，再過60目篩，取粗顆粒，作為化蛹的土壤基質(zhì))。將剛羽化的黃野螟成蟲單獨(dú)放入直徑3.0 cm、高11.0 cm的塑料離心管內(nèi)，用棉簽飼喂15%蔗糖溶液補(bǔ)充營養(yǎng)，成蟲羽化后0～24 h視為1日齡，24～48 h為2日齡，依此類推。黃野螟培養(yǎng)條件為室溫(20～28 ℃)，濕度70%～80%，成蟲光周期/暗周期為12 h/12 h。待測及待解剖的黃野螟在試驗(yàn)前喂食后放入黑暗環(huán)境中靜置4 h以上，進(jìn)入求偶行為活躍的暗周期，以保證性信息素正處于大量分泌階段。取樣后立即進(jìn)行解剖，開展試驗(yàn)。

1.2 雌蟲解剖物氣味EAG測定參照文獻(xiàn)[18]，選擇20頭在黑暗環(huán)境中靜置4 h以上的2日齡雌蛾，使用微型眼科剪刀將其腹末第8、9節(jié)剪下后放置樣品瓶內(nèi)使用50 μL重蒸正己烷將其淹沒，在4 ℃浸提2 h，將粗提物轉(zhuǎn)移至干凈的樣品瓶內(nèi)，冷藏備用。

因?yàn)槲墨I(xiàn)方法提取的雌蛾性腺樣品對雄蛾觸角電生理反應(yīng)不明顯，解剖雌蛾各部位作為樣品，使用觸角電位儀重新定位對雄蛾觸角有強(qiáng)電生理活性反應(yīng)的雌蛾信息素來源部位。解剖方法：使用鑷子和解剖剪將雌蛾解剖為頭部(H)、胸部(T)、腹部(AB)、翅(W)4個分段。將能引起雄蛾強(qiáng)電生理反應(yīng)的雌蛾腹部進(jìn)一步細(xì)分為腹部前段(AF)(腹部第1、第2節(jié))、腹部中段(AM)(腹部第3、第4、第5節(jié))、腹部后端(AH)(腹部第6、第7、第8、第9節(jié))3個分段。

在2.0 mL滴管內(nèi)放入潔凈的小團(tuán)脫脂棉，后將雌蛾各分段解剖物以及1頭在黑暗環(huán)境中靜置4 h以上的2日齡雌蛾分別放入滴管中。使用打孔器將濾紙打成小片狀，使用重蒸正己烷潤洗小紙片，在風(fēng)干后的小紙片上滴加5.0 μL黃野螟雌蛾性腺粗提液，揮干溶劑后將其放入2.0 mL氣味管內(nèi)；以同樣方法在風(fēng)干的小紙片上滴加5.0 μL正己烷后將其放入2.0 mL滴管內(nèi)作為對照(CK)。所有解剖物和完整雌蛾均分別放入滴管中，并做好標(biāo)記。雄蛾在3組試驗(yàn)中分別測試52、48和48頭；雌蛾在2組試驗(yàn)中分別測試36和24頭。每3次測試，更換一次雌蛾解剖物及提取物。

對雄蛾觸角進(jìn)行的EAG試驗(yàn)中，共有使用CK、GE、H、T、AB、W、FM和CK、AF、AM、AH以及CK、GE、AM、AB的3組對照試驗(yàn)；而在對雄蛾觸角進(jìn)行的EAG試驗(yàn)中，僅進(jìn)行了使用CK、GE、H、T、AB、W、FM和CK、AF、AM、AH的2組對照試驗(yàn)。

EAG系統(tǒng)包括：1臺IDAC-4數(shù)據(jù)記錄控制器(Syntech,德國)、2個GAIN 10X通用單端電極(Syntech,德國)以及1臺CS-55刺激氣流發(fā)生器(Syntech,德國)。在每一次測試中，都切下黃野螟的頭部，將其連接至裝有生理鹽水的接地玻璃電極中，用虹膜剪剪開2個觸角端部第一小節(jié)，并將其分別安裝在2個同樣裝有生理鹽水的玻璃記錄電極內(nèi)，用0.4 mm 的銀絲將玻璃電極分別連接到2個探頭輸入端和1個接地之間，電極中充滿生理鹽水。背景氣流使用超純水加濕后，流經(jīng)去除靜電的接地銅網(wǎng)，調(diào)節(jié)流速使味管出口風(fēng)速42.0 cm/s，刺激氣流為補(bǔ)償接入，切換氣味時，總流量不變，無氣流振動干擾。每次刺激2.0 s，每次刺激之間等待25.0 s更換氣味源。使用GC-EAD V4.6軟件(SYNTECH,德國)分別記錄雌、雄蛾的觸角電位響應(yīng)值，以供分析。

1.3 活性腺體的 HS-SPME-GC-MS聯(lián)用分析將有最強(qiáng)EAG反應(yīng)的蟲體分段組織樣品，轉(zhuǎn)入潔凈的2.0 mL樣品瓶(Agilent,美國)中，使用SPME在室溫下頂空提取1.5 h后進(jìn)行GC-MS熱解析。同時還剪取雄蟲腹部作對比，每個樣品測試3次。

GC-MS儀器為HP 7890A-5975B GC-MS系統(tǒng)(Agilent,美國)，所用色譜柱為HP-5ms(30 m × 250 μm × 0.25 μm,Agilent,美國)，載氣設(shè)置為1 mL/min(He氣，純度≥99.999%)。將SPME提取到的揮發(fā)氣味以不分流的形式在進(jìn)樣口溫度為250 ℃的條件下，注入到GC-MS的進(jìn)樣口中。設(shè)置柱箱的升溫程序：以50 ℃的初始溫度保留4 min，后以10 ℃/min升至280 ℃后保留15 min；EI源加熱至230 ℃，電離能量為70 eV；MS四極桿加熱到150 ℃；掃描質(zhì)量范圍為m/z 28.5 ～ 300，閾值為10。最后使用MSD ChemStation軟件(Agilent,美國)來分析數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理使用Origin軟件對雌、雄蛾各樣品的EAG響應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量方差分析(One-way ANOVA)，樣品間平均值的差異使用Sidak法檢測(P<0.05)。對兩性成蟲各自最有活性的樣品EAG活性差異進(jìn)行T檢驗(yàn)分析(P<0.001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 觸角電位

2.1.1黃野螟雄蛾EAG反應(yīng)。黃野螟雄蛾觸角對雌蛾各部位解剖樣品的EAG反應(yīng)結(jié)果見圖1。當(dāng)使用雌蛾不同解剖部位物氣味刺激雄蛾觸角，不同樣品氣味刺激對雄蛾產(chǎn)生的EAG響應(yīng)有顯著影響[ANOVA∶ F(1,51)=895.99 ,P<0.05]，其中雄蛾對雌蛾腹部分段(AB)的響應(yīng)最強(qiáng)(37.69±1.18)mV(圖1A )。當(dāng)使用雌蛾腹部不同分段解剖物氣味刺激雄蛾觸角時，分段樣品氣味刺激對雄蛾EAG響應(yīng)有顯著影響(ANOVA∶ F(1,47)= 1 621.63,P<0.005)，其中雄蛾觸角對雌蛾腹部中段(AM)的EAG反應(yīng)最強(qiáng)[(36.33±1.26)mV](圖1B)；當(dāng)使用前述2個分析中最有活性的2個樣品(AB與AM)與文獻(xiàn)中腺體提取物的氣味(GE)[16]刺激雄蛾觸角時，雄蛾對雌蛾腹部中段[(36.60±1.74)mV]和對整個腹部[(35.04±1.66)mV]的EAG響應(yīng)值差異不顯著(T檢驗(yàn),t=1.32,P>0.05)，但均顯著高于文獻(xiàn)提到的雌蛾腺體提取物氣味刺激雄蛾時產(chǎn)生的EAG響應(yīng)值[GE:(15.70±1.15)mV](T檢驗(yàn),AM:GE,t=17.78,P<0.05;AB:GE,t=16.45,P<0.05)(圖1C)。

2.1.2黃野螟雌蛾EAG反應(yīng)。在測試雌蛾對其他雌蛾解剖物氣味的EAG響應(yīng)時，盡管雌蛾表現(xiàn)出同樣的響應(yīng)模式，即雌蛾不同解剖部位氣味對雌蛾產(chǎn)生的EAG響應(yīng)有顯著影響[ANOVA:F(1,31)=320.14,P<0.05]，其中對腹部分段的氣味(AB)響應(yīng)最強(qiáng)[(8.93±0.47)mV](圖1D)；雌蟲腹部分段解剖物響應(yīng)顯著[ANOVA:F(1,27)=275.82,P<0.05]，其中對腹部中段(AM)的響應(yīng)最強(qiáng)[(8.12±0.48)mV](圖1E)。雌(n=56)、雄(n=100) 兩性成蟲觸角對最強(qiáng)活性樣品(AM、AB)的EAG響應(yīng)有明顯的性二型(P<0.001)(圖1F)。

注：A.雄蛾對雌蛾各解剖分段氣味的EAG響應(yīng);B.雄蛾對雌蛾腹部前、中、后3段氣味的觸角電生理響應(yīng);C.雄蛾對雌蛾性腺提取物、腹部中段、腹部的EAG反應(yīng);D.雌蛾對雌蛾各解剖分段氣味的EAG響應(yīng);E.雌蛾對雌蛾腹部前、中、后3段氣味的EAG響應(yīng);F.雌蛾、雄蛾對能產(chǎn)生強(qiáng)EAG響應(yīng)的分段(AM、AB)氣味的EAG反應(yīng)。在圖A、B、C、D、E中，CK代表對照組氣味,GE代表雌蛾性腺提取物氣味,H代表雌蛾頭部氣味,T代表雌蛾胸部氣味,AB代表雌蛾腹部氣味,W代表雌蛾翅氣味,FM代表整個雌蛾的氣味,AF代表雌蛾腹部前段的氣味,AM代表雌蛾腹部中段的氣味,AH代表雌蛾腹部后段的氣味。圖F中FM與M分別代表雌蛾與雄蛾。不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)。n表示樣本量。圖F中***表示具有極顯著差異(P< 0.001)。 Note: A.Male EAG responses to female body dissections;B.Male EAG response to female dissected abdominal segments,AF,AM and AH;C.Males response to GE,AM and AB;D.Female EAG response to female body dissections;E.Male EAG response to female abdominal dissections;F.Comparison of male and female response to candidate pheromone resources (AM and AB).GE is the extract of gland ( tip segments of female abdomen ) reported in reference,H is the head,T is thorax,AB is whole abdomen,W is short for four wings,FM is short for female,AF is the forepart of abdomen,AM is the middle abdominal segments,AH is the hind-part of abdomen and M is short for males.Different lowercases indicated significant difference (P<0.05). n indicated number of sample.*** indicated significant difference (P<0.001).圖1 黃野螟性信息素來源電生理活性鑒定Fig.1 Identification of electrophysiological active sex pheromone sources in Heortia vitessoides Moore

2.2 黃野螟雌、雄蛾腹部揮發(fā)物成分檢測利用SPME分別頂空提取了雌蛾腹部各解剖分段以及雄蛾腹部的揮發(fā)物后，使用GC-MS來檢測揮發(fā)物氣味。結(jié)果表明，雌、雄蛾腹部揮發(fā)物成分有性二型差異(圖2)。雌蛾的腹部中段樣品中含有2個雌蛾特異的化合物(圖2中以“*”標(biāo)出)，雌蛾腹部末段也含有這些特異活性化合物，但其含量較少，而雌蛾腹部前段及雄蟲腹部均不含這些化合物。質(zhì)譜檢索結(jié)果分析表明2個成分為信息素類似物，但結(jié)構(gòu)未知。

3 結(jié)論與討論

該研究將雌性黃野螟不同部位進(jìn)行解剖后使用不同部位分段對黃野螟雄蛾進(jìn)行EAG試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雌蛾腹部中段對雄蛾產(chǎn)生的觸角電位響應(yīng)最強(qiáng)，其活性高于文獻(xiàn)報(bào)道的雌蛾腹部第8、9節(jié)的提取物[16]對黃野螟雄蛾所產(chǎn)生的觸角電生理響應(yīng)值，推測黃野螟性信息素主要富集于雌蛾腹部中段。使用SPME對雌蛾腹部3個分段進(jìn)行了揮發(fā)物提取，用雄蛾腹部揮發(fā)物作為對比，通過GC-MS檢測TIC發(fā)現(xiàn)了雌蛾腹部中段具有2種雌蟲特異的活性化合物，這2種化合物在雌蛾腹部后端中也少量存在。這與腹部中段EAG響應(yīng)最高，腹部后段EAG響應(yīng)次高相對應(yīng)。后續(xù)需要進(jìn)一步開展氣相色譜-觸角電位聯(lián)用(gas chromatography-electroantennographic detection,GC-EAD)技術(shù)進(jìn)行化合物活性確認(rèn)。

注：“*”標(biāo)記了雌蛾腹部強(qiáng)活性段的特有成分。 Note:“*” Compounds specific to highly active female abdominal segments.圖2 雌蛾腹部分段解剖揮發(fā)物與雄蛾腹部揮發(fā)物總離子流圖比較Fig.2 TIC comparison for the volatile compounds from the female and male dissections

該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃野螟雌蛾腹部中段對雄蛾觸角產(chǎn)生較強(qiáng)電生理響應(yīng)，為含雌蛾特異性化合物最多的體段，在今后提取黃野螟雌蛾信息素的工作中，主要提取部位應(yīng)是其腹部中段。而腹部末段對雄蛾觸角產(chǎn)生的電生理響應(yīng)為次強(qiáng)，且含有一定量的雌蛾特異性化合物。這也與文獻(xiàn)報(bào)道的腹部末端行為特性及相應(yīng)提取物的引誘活性相吻合，如對黃野螟的生殖行為節(jié)律的研究發(fā)現(xiàn)雌蛾在求偶時會將其腹部第8、第9節(jié)伸出腹部，從而吸引雄蛾前來進(jìn)行交配[19]；且最末端的腹節(jié)提取物能夠在野外誘捕到適量的雄蛾[18]。這也提示第6～9腹節(jié)可能也具有信息素分泌結(jié)構(gòu)。

在研究方法上，該研究也再次明確了鑒定性信息素來源作為關(guān)鍵環(huán)節(jié)在昆蟲信息素鑒定研究中的重要性。東南亞熱帶森林昆蟲具有特殊的昆蟲區(qū)系，屬于東洋區(qū)，許多昆蟲的形態(tài)和生理特征與環(huán)境壓力相適應(yīng)，具有區(qū)域特點(diǎn)，需仔細(xì)區(qū)別驗(yàn)證。將來還需要進(jìn)一步開展組織切片觀察該研究所確認(rèn)的分泌部位結(jié)構(gòu)，確認(rèn)腺體分泌組織是否存在于黃野螟成蟲腹部中段的第3、4、5、6節(jié)中。