添加兒茶素對噴霧干燥后的大豆分離蛋白結構、功能性和消化特性的影響

石長波，孫昕萌，趙鉅陽，袁惠萍，梁昌謀

（哈爾濱商業大學旅游烹飪學院，黑龍江哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（Soybean Protein Isolate，SPI）是一種優質的植物蛋白，具有來源廣泛、價格低廉且營養價值高等優點，同時具有可降解、熱穩定、無污染、綠色環保等優良性能。商用SPI通常高溫噴霧干燥生產，這會引起SPI一定程度的變性和聚集，從而使溶解性等功能性質降低，限制了SPI在食品工業中的應用[1]。因此，為了保持或改善噴霧干燥后大豆分離蛋白的功能特性，可以嘗試噴霧干燥前在料液中添加外源物降低噴霧干燥引起的熱變性或者抑制熱聚集[2]。有研究表明，在不使用有機溶劑的情況下，多酚的加入可防止乳鐵蛋白的熱聚集[3]。Yan等[4]研究了預熱處理對多酚-樟子仁分離蛋白結構和功能特性的影響，結果發現加入了多酚后蛋白質的聚集程度降低，并且乳化性增強。Liu等[5]發現酚類化合物中的羥基基團可以與蛋白質中的游離氨基和色氨酸等發生反應，二者之間的相互作用有助于提高蛋白質的變性溫度，從而抑制熱處理中蛋白質的聚集。

兒茶素是一種黃酮類多酚化合物[6]，其羥基含量高并且具有多個適合蛋白質結合的反應位點，大量研究已表明SPI側鏈中的氨基和巰基能夠與兒茶素的酚羥基結合形成氫鍵，并且蛋白質上的某些氨基酸基團或殘基也會和兒茶素的酚羥基或者苯環結合形成離子鍵、疏水作用、范德華力等[7]，進而改變蛋白質的結構和功能特性，進一步研究也發現通過引入兒茶素可以干預蛋白質熱誘導聚集，并提高其某種功能性和生物活性。Wang等[7]將兒茶素與熱處理后的α-乳清蛋白復合，結果發現兒茶素的加入提高了α-乳清蛋白的變性溫度，并增強了α-乳清蛋白的抗氧化和乳化活性。Zhou等[8]發現將兒茶素與冷凍干燥的大豆分離蛋白復合后，蛋白質的抗氧化性和熱穩定性增加，并且提高了蛋白的消化率。

盡管目前關于蛋白質與多酚相互作用的研究較多，但多針對于實驗室條件下制備的冷凍干燥的蛋白質，而在實際加工中SPI往往通過噴霧干燥技術制備，而關于噴霧干燥條件下大豆分離蛋白與兒茶素結合的研究較少，多酚與SPI相互作用后是否會受噴霧干燥的影響還尚不明確，通過兒茶素干預SPI噴霧干燥過程中的熱聚集行為這一設想也有待驗證，基于此本研究系統探究了噴霧干燥條件下兒茶素與SPI復合物的形成機制，以及兒茶素對SPI的結構（表面疏水性、巰基含量）包括結合親和力的變化規律。通過對兒茶素-大豆分離蛋白復合物結構和功能特性的變化規律的探究，以期為兒茶素與大豆分離蛋白的復合提供理論依據，擴大其應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 實驗室自制；兒茶素 合肥博美生物公司；色拉油 市售；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、氯化鈉、胃蛋白酶（酶活1:3000）、胰酶（酶活1:4000）、胰脂肪酶（酶活1:30000）、膽鹽（純度≥60%）、二水氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 阿拉丁試劑公司；其他化學試劑均為分析純。

LS55熒光分析儀 珀金埃爾默股份有限公司；TMS-Touch 250N質構儀 美國Food Technology Corporation；H-PTD20流變儀 奧地利安東帕有限公司；L535-1型離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的提取及復合物的制備 參考Zheng等[9]的制備方法。將400 g豆粕溶于6 L蒸餾水中，充分溶解后將溶液pH調為7.8。攪拌2 h后離心（8000×g，20 min），取離心后的上清液用2 mol/L HCl將溶液pH調至4.5，再次離心（8000×g，10 min），用5倍體積蒸餾水將沉淀溶解，攪拌均勻后離心（8000×g，10 min），取離心后的沉淀加入適量蒸餾水，并將溶液pH調至7.0，此時得到SPI溶液。

根據前期研究結果，將兒茶素按照大豆分離蛋白質量濃度的0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%比例添加到SPI溶液中，并將此溶液在25 ℃下攪拌24 h后，于4 ℃在磷酸鹽緩沖溶液中透析（截留分子量為8000～14000 kDa）48 h，此時得到兒茶素-大豆分離蛋白復合物溶液。為模擬SPI商業熱加工條件，復合后的溶液進行噴霧干燥處理，制備不同結合親和力的熱誘導復合物干燥樣品。其中噴霧干燥條件參考Chen等[10]并做適當改動，進風溫度根據前期研究結果設置為170 ℃，料液流速3.5 mL/min，所有干燥樣品備用待測。

1.2.2 兒茶素/大豆分離蛋白復合物結合親和力的測定 參考劉雅云[11]多酚荷載率和裝載含量的測定方法并做適當修改。大豆分離蛋白包埋兒茶素比率（荷載率）通過公式計算：

式中：未結合的兒茶素是指復合物經過離心后（8818×g，20 min）沉淀中兒茶素的含量（mg）。取離心后沉淀部分加入無水乙醇將其溶解，再次離心（8818×g，20 min）后，測定上清液在280 nm處的吸光值，兒茶素的具體含量由標準曲線換算。此外大豆分離蛋白與兒茶素復合物裝載兒茶素的含量（裝載量）通過下公式計算：

式中：包埋兒茶素的含量指大豆分離蛋白結合兒茶素的含量（mg），加入大豆分離蛋白的含量根據雙縮脲法進行測定，并根據標準曲線換算出具體含量（g）。

1.2.3 表面疏水性（H0）的測定 按照Jiang等[12]的方法，使用8-苯氨基-奈酚-磺酸（ANS）對SPI和兒茶素-大豆分離蛋白復合物（SPI-C）的表面疏水性進行檢測。用10 mmol/L，pH7.0 的磷酸鹽緩沖溶液配制不同質量比的SPI-C復合物，將樣品溶液置于10000×g下離心30 min，取2 mL濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液與20 μL濃度為8 mmol/L的ANS混合。激發和發射波長分別為390、468 nm，狹縫寬度設為5 nm，掃描速度設置為10 nm/s，在以上參數下記錄熒光強度。H0為熒光強度與蛋白質濃度的比值。

1.2.4 巰基含量的測定 按照Ellman[13]的方法稍作改動。將0.04 mL Ellman試劑、5 mL Tris-甘氨酸緩沖液和1 mL樣品溶液混合均勻，40 ℃下保溫25 min，在412 nm下測量溶液的吸光值。以含有Ellman的Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對照。每克蛋白含有的游離巰基的量（μmol）通過下列公式計算：

式中：73.53=106/1.36×104，1.36×104為摩爾消光系數；CSPI為樣品中蛋白質的濃度（mg/mL）。

1.2.5 溶解性的測定 參考Stübler等[14]的方法，將蛋白質濃度為2 mg/mL的SPI和SPI-C溶解于pH 6.25的磷酸鹽緩沖液中，然后于5000×g、4 °C下離心15 min，蛋白質溶解度的計算方法為：

1.2.6 乳化性及乳化穩定性的測定 參考祝鋼等[15]的方法。將樣品蛋白質濃度配制成10 mg/mL，然后取9 mL的樣品溶液加入3 mL大豆油（即二者的比例為3:1），高速勻漿器10000 r/min攪打1 min后待測備用。從制備好的乳狀液底部取100 μL，再加入濃度為0.1%的SDS溶液10 mL，二者混勻后在500 nm處測吸光值，用SDS溶液做空白。10 min后再次取溶液進行測定。乳化性及乳化穩定性分別按下式計算：

1.2.7 凝膠性的測定 參考蔡劭愷[16]的方法稍作修改。將各組樣品溶液配為蛋白濃度為12%的溶液，20 ℃下磁力攪拌器混勻攪拌30 min，之后于90 ℃水浴加熱30 min，冷卻后放置于4 ℃冰箱中貯藏12 h。樣品在室溫下放置30 min后再質構儀測定所需參數。選用P/0.5的探頭，以穿刺模式進行測定，測前速度：60 mm/min，測試速度：200 mm/min，測后速度：600 mm/min，記錄測試峰的頂點，即為測定凝膠的硬度（N）。

1.2.8 參與形成凝膠作用力的測定 凝膠的分子間作用力測定方法參考Sun等[17]的方法并做適當改動。凝膠溶解度被用來檢測穩定蛋白凝膠結構的分子間作用力。按照1.2.5的方法制備不含任何變性劑的蛋白凝膠。根據檢測需要，配制以下三種凝膠溶解液：含0.7 mol/L的NaCl；6 mol/L鹽酸胍（GuHCl）；10 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）分別溶解在含50 mmol/L PBS中（pH6.25）。分別將1 g凝膠溶解在上述三種凝膠溶解液中，在80 ℃下水浴加熱3 h，冷卻后離心15 min（4 ℃、10000×g），取上清液測蛋白質含量，計算出凝膠溶解度。

1.2.9 流變特性分析 參考賈娜等[18]方法稍有改動。將SPI以及SPI-C溶液均勻涂抹在測試平臺上，除去氣泡。將測試頻率調整為0.2 Hz，應變力設置為2%，初始和終止溫度分別設為30、90 ℃，升溫速率設為4 ℃/min。測定指標為流變的彈性模量G” 。

1.2.10 原子力顯微鏡（AFM）分析 參考李穎暢等[19]的方法略做修改，將SPI和SPI-C溶液稀釋至濃度為 20 μg/mL，然后吸取 4 μL溶液，涂在載玻片上。放置于載物臺進行觀察，采用輕敲模式。

1.2.11 體外消化模擬實驗

1.2.11.1 模擬消化液的配制 參照Menezes等[20]的方法稍作修改，建立胃-小腸兩步連續消化模型。

胃液：2 g/L 氯化鈉、7 mL/L 濃鹽酸和9600 U/L胃蛋白酶混合，并調節溶液pH為1.2；

腸液：分別取膽鹽3.75 g用去離子水定容至50 mL；胰蛋白酶514.29 U/mL、胰酶68.57 U/mL。

電解質溶液：分別取1.101 g 二水氯化鈣、6.561 g氯化鈉，用去離子水定容至30 mL。

1.2.11.2 體外連續消化 將冷凍干燥的天然SPI、噴霧干燥的天然SPI和各濃度下兒茶素-SPI復合物（兒茶素添加量分別為0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%）樣品分別與模擬胃液、腸液于37 ℃水浴保溫10 min后，取等體積相應的樣品溶液與模擬胃液置于離心管內，用1.0 mol/L NaOH將混合物pH調至2.0，置于37 ℃以100 r/min水浴振蕩，分別取反應時間為0、30、60、90和120 min的消化產物置于試管中，立即于100 ℃煮沸滅菌，冷卻備用。后將離心管溶液pH調至6.8，取胃消化后的溶液30 mL，分別加入1.5 mL電解質溶液、2.5 mL膽鹽溶液和3.5 mL酶溶液（胰蛋白酶和胰酶分別為514.29、68.57 U/mL），并用1.0 mol/L NaOH將溶液pH調至7.0，將離心管置于37 ℃水浴搖床中，分別取反應時間為150、180、210和240 min的消化產物于試管中，冷卻備用。

體外消化率的計算公式如下：

式中： C0為消化前的總蛋白含量，mg/mL； C1為消化后的蛋白含量，mg/mL。

1.3 數據處理

每組試驗設置3個平行樣品，結果采用平均數±SD表示。數據分析采用Statistix 8.1分析差異顯著性。采用Sigmaplot 12.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 兒茶素添加量對兒茶素/大豆分離蛋白結合情況的影響

兒茶素荷載率以及裝載含量見圖1和圖2。由圖1可知，隨著兒茶素添加量的增加，SPI-C對兒茶素的載荷率呈先上升后趨于穩定的趨勢，說明隨著兒茶素濃度的增加，二者相互作用程度逐步增強，表明SPI-C復合物的結合程度增加。推測的原因可能是SPI的空間結構在噴霧干燥的過程中展開，導致兒茶素與暴露出來的疏水基團結合，從而降低了SPI表面疏水性，提高了二者的結合程度[21]。Chen等[22]的研究也發現了類似的結論。且由圖2兒茶素裝載含量的變化趨勢可知，兒茶素添加量為0.25%～1.75%時，其添加量與兒茶素裝載含量呈正相關。

圖1 不同兒茶素添加量與SPI相互作用對兒茶素荷載率的影響Fig.1 Effects of the interaction between different amounts of catechins and SPI on the entrapment rate of catechins

圖2 不同兒茶素添加量對SPI裝載兒茶素含量的影響Fig.2 Effects of different catechin levels on the catechin content of SPI loading

2.2 兒茶素添加量對大豆分離蛋白表面疏水性（H0）的影響

兒茶素對大豆分離蛋白表面疏水性的影響如圖3所示。表面疏水性（H0）是蛋白質的重要特性之一，在維持蛋白質穩定性和生物活性方面起著重要作用[23]。H0是衡量SPI分子表面疏水基團數目的重要指標，也是影響分子間相互作用的主要因素之一。由圖3可知，隨著兒茶素添加量的增加，溶液中表面疏水性的逐漸降低后趨于穩定，這與荷載率的趨勢相反。蛋白質的表面疏水性下降原因是兒茶素中所含的羥基屬于親水基團，羥基的存在能夠使蛋白質的表面疏水性降低[24]。另一方面，在噴霧干燥過程中兒茶素可與蛋白質暴露的疏水氨基酸殘基結合[25]，從而減少ANS的結合位點，降低了表面疏水性。Li等[26]發現原花青素的添加會導致乳鐵蛋白的疏水性降低，起泡性增強。

圖3 兒茶素添加量對表面疏水性的影響Fig.3 Effects of catechin addition on surface hydrophobicity

蛋白質經過熱誘導后，暴露出埋在蛋白質內部的疏水基團[27]，促進了酚苯環與蛋白質芳香側鏈的疏水結合[24]，使得表面疏水性降低。此外，研究也表明熱處理會使蛋白質展開或者部分展開、聚集、分子柔韌性和疏水-親水平衡發生變化，進而影響蛋白質的功能特性[24]。

2.3 兒茶素添加量對大豆分離蛋白游離巰基含量的影響

兒茶素添加量對游離巰基含量的影響如圖4所示。巰基基團是指蛋白質表面可與Ellman試劑反應的巰基。通常，有關巰基的化學反應涉及多種食品質量指標。由圖4可以發現隨著兒茶素添加量的增加，SPI-C復合體系中巰基的含量逐漸下降，這是因為兒茶素的羥基能夠與SPI中的巰基結合。并且隨著兒茶素添加量的進一步增加，可與SPI巰基結合的羥基基團逐漸增多，進而蛋白質的巰基含量逐漸減少[28]。曹艷蕓[29]的研究也得到類似結論，乳清蛋白的巰基含量在添加兒茶素后降低。此外，熱處理會加強巰基-二硫鍵之間的交換反應[4]，而兒茶素的存在，導致分子內的二硫鍵含量增多，蛋白質與蛋白質分子間的二硫鍵減少[21]，從而推測兒茶素能夠干預蛋白質的熱聚集。

圖4 兒茶素添加量對巰基含量的影響Fig.4 Effects of catechin addition on sulfhydryl content

2.4 兒茶素添加量對大豆分離蛋白溶解性的影響

兒茶素添加量對溶解性的影響如圖5所示。蛋白質的溶解度決定了其在食品工業中的應用，蛋白質的高蛋白溶解度有利于改善其加工性能并擴大其應用范圍[30]。王孟云等[31]研究發現SPI未經噴霧干燥前溶解性約為88.74%，然而如圖5兒茶素對大豆分離蛋白溶解性的影響所示，本研究經過噴霧干燥后的SPI溶解性降低至69.90%，說明噴霧干燥處理會大大降低SPI的溶解性。但是通過添加兒茶素可以適當提高SPI的溶解性（圖5），在兒茶素添加量為1%時，SPI的溶解性達到最大為95.2%，較未添加兒茶素時提高36.4%。兒茶素的疏水區能夠通過疏水相互作用與SPI疏水氨基酸結合，降低SPI的表面疏水性，從而提高SPI的溶解度[32]。另一方面SPI表面附著兒茶素的羥基和羧基，進一步增加了SPI表面的親水性，使溶解度提高[32]。然而當兒茶素的添加量繼續增加時，導致體系中兒茶素濃度過大，兒茶素末端占據蛋白質的多數結合位點，此時兒茶素分子很難找到合適位點與蛋白質結合，引起蛋白質分子之間交聯，從而導致溶解度下降[33]。由此可知，適當的兒茶素添加量能夠使大豆分離蛋白的溶解性提高。研究發現熱處理會導致蛋白質的變性聚集，從而導致溶解性下降[31]。但在加入兒茶素后，噴霧干燥處理的SPI的溶解性增加，結合巰基與表面疏水性的結果推測是因為加入兒茶素能夠與SPI暴露的疏水氨基酸殘基結合，并干預蛋白質與蛋白質分子間的二硫鍵的形成，抑制蛋白質的變性聚集，從而使噴霧干燥后SPI的溶解性提高。

圖5 兒茶素添加量對大豆分離蛋白溶解性的影響Fig.5 Effects of catechin addition on solubility of soybean protein

2.5 兒茶素添加量對大豆分離蛋白乳化及乳化穩定性的影響

兒茶素添加量對乳化及乳化穩定性的影響如圖6所示。乳化性反映了蛋白質在油水界面形成和穩定乳液的能力，乳化穩定性能夠反應乳液抵抗分離和保持分散的強度[34]。從圖6乳化性的變化可以看出，隨著兒茶素添加量的增加，復合體系的乳化性及乳化穩定性呈現先增加后降低的趨勢，在兒茶素添加量為1%時，乳化性達到最大值為90.03 m2/g，比對照組的乳化活性提高了13.7%，乳化穩定性為36.3%，比對照組乳化穩定性提高了14.3%，說明兒茶素的加入干預了SPI的熱聚集，提高了其乳化性能。乳化特性取決于蛋白質-蛋白質和蛋白質-脂質相互作用，兒茶素能夠改變蛋白質-蛋白質的相互作用，降低自由能，從而降低油水界面的界面張力[35]。加入兒茶素后乳化性能的改善可能是噴霧干燥導致蛋白質分子的構象發生變化，使最初位于蛋白質內部的疏水團簇的暴露[36]，增強了與兒茶素的疏水相互作用，從而使改性后蛋白的柔韌性和溶解度的增加，進而增加了蛋白對油水表面的吸附能力[37]。當兒茶素添加量超過1%時，兒茶素與大豆分離蛋白的交聯程度增大，但兒茶素活性基團如巰基含量下降，導致不足以形成大的交聯網狀結構，導致大豆分離蛋白的乳化性能下降。Yan 等[35]研究發現表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠提高大豆分離蛋白的乳化性能，與本文的研究結果類似。

圖6 兒茶素添加量對兒茶素/大豆分離蛋白符合體系乳化性及乳化穩定性的影響Fig.6 Effects of catechin addition on emulsifying property and emulsifying stability of catechin/soy protein coincidence system

2.6 兒茶素添加量對大豆分離蛋白凝膠性的影響

兒茶素添加量對凝膠性的影響如圖7所示。凝膠性反映了SPI可形成立體空間網狀結構的能力，是評價SPI功能性質的重要指標之一，對其在食品中的應用起著至關重要的作用。由圖7可知，與對照組相比，兒茶素的添加均顯著增大了SPI凝膠性，說明兒茶素能夠改善SPI噴霧干燥后的凝膠強度。當兒茶素添加量為0.25%時，SPI凝膠性顯示最大值，與對照組相比提高了43.6%，而后再繼續增大兒茶素添加量，SPI凝膠性反而下降，這可能是由于起初隨著兒茶素的加入，為溶液提供了可與蛋白質氨基酸殘基結合的活性羥基，促進溶液中蛋白質網絡結構的形成[38]。隨著兒茶素添加量的增加，過量的兒茶素將SPI中活性基團掩埋，導致凝膠硬度下降[39]。Jongberg等[40]研究表明高濃度的綠茶提取物可與蛋白質的巰基反應生成巰基-醌加合物，從而阻止蛋白質生成穩定的二硫鍵，導致蛋白質凝膠性降低。其他研究也發現中等或高濃度的酚類物質會損害凝膠性質[41]。此外，Bourvellec等[42]研究發現熱處理導致SPI變性和構象發生變化，會暴露更多與多酚的結合位點。因此，添加兒茶素能夠促進噴霧干燥后SPIC間的相互作用，增強凝膠的網絡結構，阻止了蛋白質-蛋白質間的相互作用，從而抑制了噴霧干燥過程中SPI的聚集[43]。

圖7 兒茶素添加量對復合體系凝膠性的影響Fig.7 Effect of catechin addition on gel properties of composite system

2.7 兒茶素添加量對大豆分離蛋白凝膠化學作用力的影響

凝膠形成過程中，氫鍵、疏水作用、二硫鍵以及靜電作用是形成蛋白凝膠網絡的主要作用力，其構成決定了蛋白凝膠的特性[44]。這些化學鍵可被特定的化學試劑破壞，通過在不同化學試劑中混合蛋白凝膠溶解度的不同，表征混合蛋白凝膠中化學鍵的變化。由于DTT能夠斷裂分子間或者分子內的二硫鍵，當蛋白凝膠在DTT中溶解的越多，在凝膠成膠起作用的分子間或者分子內的二硫鍵也就越多；疏水相互作用和氫鍵能夠被GuHCl所破壞打斷，因此蛋白凝膠在GuHCl溶解的越多，在凝膠成膠起作用的疏水相互作用和氫鍵也就越強；NaCl可以用來測定在凝膠網絡結構形成的過程中的靜電相互作用和其他一些較弱的分子作用力。由圖8可知，溶出蛋白質的含量隨兒茶素添加量的增加呈現先增加后下降的趨勢，并且各個處理組均在0.25%時凝膠的溶解性達到最大值，表明此時參與凝膠形成的作用力最大，這一結果與凝膠硬度的結果一致，在此添加量下凝膠硬度最大。兒茶素的添加增強了凝膠的氫鍵、二硫鍵以及疏水相互作用，并且凝膠在DTT中的溶解度最高，說明二硫鍵是維持SPI-C復合物的凝膠網絡結構的主要作用力。

圖8 不同兒茶素添加量的蛋白凝膠作用力的測定Fig.8 Determination of protein gel force of different catechins

與對照組相比，添加兒茶素后溶液中溶解的二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05）。二硫鍵含量的增加可能是由于兒茶素含有的活性基團在熱處理下很容易被氧化成醌[38]，進而這些活性基團通過氧化蛋白質表面的巰基來促進蛋白質之間通過二硫鍵之間的連接[45]。凝膠在GuHCl中的溶解度隨兒茶素添加量的增加先上升后下降，這是因為低濃度的兒茶素有助于凝膠網絡中氫鍵的形成，過量的兒茶素會改變熱誘導過程中SPI的聚集行為[38]，阻礙SPI與水的結合，導致氫鍵和疏水相互作用降低[46]。凝膠在NaCl中的溶解度較低，且隨著兒茶素的添加含量變化不大，說明靜電相互作用對凝膠形成的影響較小。

2.8 兒茶素添加量對大豆分離蛋白流變特性的影響

大豆分離蛋白在加熱過程中分子的形態和性質的變化，能夠用動態流變特性來表征。儲能模量（G” ）代表了測試樣品在一定的測試參數如應變、應力下儲存能量的能力，G” 的大小表征了凝膠網絡的致密程度[47]。在加熱過程中，兒茶素添加量對大豆分離蛋白儲能模量的影響如圖9所示。

圖9 不同兒茶素添加量的大豆分離蛋白儲能模量隨溫度變化曲線Fig.9 Curve of storage modulus of soybean protein with different catechin addition with temperature

SPI及SPI-C在30～60 ℃范圍內隨著溫度的升高儲能模量下降較快，這是因為溫度的升高破壞了蛋白質分子內的氫鍵，進而導致G′下降[48]。隨著溫度的繼續升高，加劇了蛋白質的亞基解離，以及分子間的運動，增加了分子碰撞機會，從而產生交聯形成凝膠[48]。添加C組的G′值高于對照組，說明添加C可以增強SPI的粘彈性，由表面疏水性的測定結果可知，C的添加導致蛋白質間的疏水相互作用降低了，這樣能夠使靜電和疏水相互作用達到平衡，進而增強了C與SPI的交聯作用[49]，從而能夠改善蛋白質的網絡結構[50]。Pantelis等[51]研究了茶多酚提取物對胃腸黏蛋白酶作用，發現與本文類似的結果，即多酚的添加能夠引起蛋白交聯。隨著C添加量的增加，G” 呈先升高后降低趨勢，并當C添加量為0.25%時，儲能模量達到最大值。這表明對于大豆分離蛋白凝膠，C添加量存在最適濃度。

2.9 兒茶素添加量對大豆分離蛋白的凝膠微觀結構

AFM可以用來表示蛋白質樣品的表觀形貌特征[52]。圖10顯示了SPI及SPI-C復合物凝膠的表面微觀形態。由圖10A可以看出，未添加兒茶素時，SPI具有無序的聚集且分布不均勻；當添加了兒茶素后，凝膠的微觀結構由不規則不均勻向規則均勻致密轉化。這是因為兒茶素的加入能夠使樣品之間交聯的程度減弱，兒茶素和SPI間的維持力（包括氫鍵、二硫鍵等）被打斷，蛋白質分子間作用力破壞，分子解聚，大顆粒蛋白減少，均勻度增加[53]。兒茶素添加量為0.25%和0.5%時，復合物分子逐漸形成較小、較為分散的聚集體（圖10B、圖10C）；隨著兒茶素添加量的進一步增大，復合物間的聚集程度有所增加，逐漸產生較大的團狀聚集體。

圖10 SPI及SPI-C 的原子力顯微鏡圖像Fig.10 AFM images of SPI and SPI-C

利用Nanoscope analysis軟件對SPI及SPI-C聚集過程進行分析，樣品號A～H的平均表面粗糙度（Ra）分別為5.153、1.090、1.1345、1.158、2.723、3.392、3.706、4.387 nm，Ra作為統計學的基本參數，能夠反應樣品表面粗糙程度的大小，即聚集程度的大小，Ra先減少后增加說明SPI隨著兒茶素添加量的增加，其微觀聚集程度呈先減小后增大的趨勢。根據2.7凝膠化學作用力的結果，得出二硫鍵是參與凝膠形成的主要作用力，由此推測添加兒茶素能夠斷開參與蛋白質凝膠的二硫鍵，使蛋白質分子適度解聚，形成均一度較好的小顆粒蛋白，進而提高蛋白質的功能性質。

2.10 兒茶素添加量對蛋白質體外消化率的影響

不同兒茶素添加量對蛋白質體外消化的影響如圖11所示。由圖11可知，噴霧干燥的SPI及SPIC復合物的消化率均高于冷凍干燥，這是因為SPI及SPI-C在噴霧干燥中發生了部分變性，進而更容易被人體吸收[54]。然而兩種干燥方式蛋白質的胃消化率均低于40%，說明只有少部分蛋白質在胃消化階段進行消化，腸消化中蛋白質的消化率升高，表明蛋白質的消化主要發生在小腸消化階段，這與郭陽[55]的研究一致。SPI的消化率顯著（P＜0.05）高于SPIC復合物。這可能是由于在SPI與兒茶素在堿性條件下共價反應后，SPI的空間結構發生改變，使其不易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶水解。

圖11 不同兒茶素添加量對蛋白質體外消化率的影響Fig.11 Effects of different catechins on protein digestibility in vitro

3 結論

本試驗探究了不同兒茶素添加量對噴霧干燥的兒茶素-大豆分離蛋白復合物結構、功能和消化特性的影響。二者結合能力的測定結果表明，載荷率和荷載量隨著兒茶素添加量的增加而增加；表面疏水性和巰基含量隨著兒茶素添加量的增加逐漸降低。功能特性的測定結果表明，在兒茶素添加量為1%時，溶解性、乳化及乳化穩定性達到最大值；在兒茶素添加量為0.25%時，凝膠硬度最大；并且參與形成凝膠的作用力結果表明SPI-C的凝膠網絡形成主要是二硫鍵的作用；原子力顯微鏡結果表明兒茶素的加入能夠抑制SPI的聚集程度。此外，體外消化結果說明蛋白質的消化主要發生在小腸階段，且兒茶素的添加會降低噴霧干燥SPI的消化率。以上試驗結果為研究噴霧干燥制備的大豆分離蛋白與兒茶素之間的相互作用提供了參考，并為植物蛋白和兒茶素復合物在食品工業中的應用奠定了理論基礎。然而目前有關于多酚-蛋白質消化特性的測定大多數是在體外進行測定，機體內部腸道菌群的變化還不清楚，在未來可加強多酚-蛋白質復合物體內方面的研究，以開發新型功能性食品。