甘薯黑斑病拮抗細菌抑菌性能及抑菌物質鑒定

王智敏，馬金伶,2，孫兆勇,2，石瑩瑩，李東炎，石晶盈,

（1.山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018；2.山東省濟寧市汶上縣人民政府，山東濟寧 272500）

甘薯中含有豐富的營養物質，包括多種必需氨基酸、維生素、膳食纖維等營養和功能成分[1-3]。但是，甘薯在采后貯藏過程中容易受病原微生物侵染造成腐爛損失，其中，由長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）侵染引起的甘薯黑斑病是主要的病害之一，長喙殼菌有很強的寄生能力，主要通過傷口侵染甘薯[4]，造成嚴重的經濟損失[5-6]。另外，由于甘薯喜溫，低溫貯藏會使甘薯發生冷害[7-8]，需要在12 ℃以上進行甘薯貯藏，但是此溫度下長喙殼菌仍然可以生長繁殖，因此，目前產業上多依賴化學殺菌劑如多菌靈等抑制黑斑病發生。但是，化學殺菌劑的長期使用會導致病原菌產生抗藥性，容易造成環境污染和農藥殘留等諸多問題[9-10]。生物防治憑借無毒無害、無污染且無抗藥性等優點，被認為是有望降低化學殺菌劑使用量或替代化學殺菌劑的有效方法[11-12]。

拮抗微生物的揮發性代謝產物對于果蔬采后病害控制有重要作用。綠葉假單胞菌（Pseudomonas adaceae）釋放的揮發性物質中含有的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-甲基-1-丁醇能有效抑制甘薯黑斑病的菌絲生長和孢子萌發[13]。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）HAB-5產生的烷烴、醇、酸等揮發性物質，對炭疽菌有較高的抑制活性[14]。枯草芽孢桿菌（B. subtilis）CF-3的揮發性代謝產物不僅能抑制褐腐菌的生長，而且還激活了桃果實的抗病相關酶，誘導果實提高抗病性[15]。因此，利用拮抗微生物產生的揮發性代謝產物來抑制采后病害，成為采后病害生物防治領域的熱點。

本研究對前期從甘薯表面和甘薯種植的土壤中分離到兩株對甘薯黑斑病有較強抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK進行抑菌性能分析[16]。通過熏蒸方法探究揮發性代謝產物對甘薯的抑菌效果，通過氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatograph-ion mobility spectrometry，GC-IMS）和氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術對分離得到的兩株拮抗菌的揮發性代謝產物組分進行分析鑒定，同時在平板上篩選出對黑斑病抑制作用較強的成分，旨在為甘薯黑斑病的防治提供新的拮抗菌株資源，為開發新型、安全的防腐保鮮劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK、克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）GK、長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata） 均由山東農業大學食品科學與工程學院果蔬采后貯藏保鮮實驗室分離、鑒定和保存；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、牛肉膏蛋白胨固體培養基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養基（NB），制備方法參照Liu等[17]；己醛（Hexanal）、2-己酮（2-Hexanone）、乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-壬酮（2-Nonanone）、異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）濃度分別為97%、99.5%、99%、99%、99%、99%、98.5% 購于北京優尼康生物科技有限公司和上海麥克林生化科技有限公司；甘薯品種為蘇薯8號采購于山東省泰安市岱岳區，挑選成熟度一致、大小均勻、果色良好、沒有病蟲害且無機械傷的新薯進行下一步實驗。

SJ-CJ-1D超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司；ZQTY-70F恒溫振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；AL204電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EPED-E2-20TF實驗室級超純水器 南京易普易達科技發展有限公司；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；8200氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS） 德國GAS公司；7010 氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS） Agilent Technologies Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌菌液熏蒸對甘薯黑斑病病斑擴展抑制率的測定 將在NA平板上生長良好的兩株拮抗菌JK、GK分別接種到1000 mL NB培養基中，在28 ℃180 r/min下培養48 h后，分別將1000 mL菌液倒入容積為20 L的密封罐的隔板下層，對照為相同體積的無菌水，隔板上層放置10個甘薯，用凡士林密封罐蓋，熏蒸1 h。在熏蒸后的甘薯果實上用打孔器打直徑為1 cm，高度為1 cm的圓孔，每個甘薯的同一面每間隔7～8 cm打一個孔，每個甘薯打三個圓孔，去除圓孔中的甘薯表皮，分別立即接種5×105個孢子囊/mL的長喙殼菌孢子囊懸浮液20 μL[18]，對照組接種同上。每個處理重復三次，每次重復處理10個甘薯，實驗重復兩次。于28±1 ℃ RH 90%條件下保濕貯藏，每5 d測量一次病斑，計算病斑擴展抑制率。

抑制率（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100

1.2.2 拮抗菌揮發性抑菌物質的測定

1.2.2.1 拮抗菌揮發性代謝產物GC-IMS測定 樣品預處理：將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養基中，28 ℃ 180 r/min培養48 h后，分別吸取10 mL于20 mL頂空進樣瓶中，對照為相同體積的NB培養基，每個處理重復兩次，分別記作JK1、JK2，GK1、GK2，CK1、CK2。

GC-IMS條件：色譜柱型號FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），IMS溫度45 ℃，色譜柱溫度40 ℃，分析時間20 min，載氣/漂移器N2，離子化模式為正離子模式，以β射線（氚，3H）進行放射處理。

自動頂空進樣條件：進樣體積為300 μL，孵育時間 10 min，孵育溫度40 ℃，進樣針溫度45 ℃，孵化轉速500 r/min。載氣流速參照邵悅春等[19]設定，初始氣相載氣流速為2 mL/min，保持2 min后，在10 min內線性增至100 mL/min，在20 min內線性增至150 mL/min。漂移氣流速為150 mL/min。

每組實驗均重復兩次，采用GC-IMS儀器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件對拮抗菌的揮發性氣味進行采集和分析，利用LAV中的Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異，Gallery Plot插件構建指紋圖譜，直觀對比樣品之間的譜圖差異，采用Dynamic PCA插件對樣品進行動態主成分分析。同時根據特征性物質保留時間和遷移時間計算每種揮發性物質的保留指數，通過GC-IMS Library Search中的NIST和IMS數據庫對揮發性代謝成分進行定性分析。

1.2.2.2 拮抗菌揮發性代謝產物GC-MS測定 采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法（HS-SPME-GCMS）分離鑒定揮發性活性物質的組分，并對平板抑菌活性進行跟蹤。將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養基中，28 ℃ 180 r/min培養48 h。將萃取頭在250 ℃進樣口老化30 min。50 ℃條件下預熱10 min后，分別用65 μm PDMS/DVB和75 μm PDMS萃取纖維頭對JK和GK揮發性物質進行頂空吸附，吸附時間30 min[20]。氣相色譜色譜柱為Rtx-5MS 毛細管色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為He，采用程序升溫的起始溫度為60 ℃，維持2 min，以5 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，再以2 ℃/min的速率升溫至250 ℃，維持3 min，運行時間 64 min。質譜條件為：電子轟擊離子源及四級桿質量檢測器，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，熱解析1 min，質量掃描范圍45～500 m/z[21-22]。

每組實驗均重復兩次，色譜分離后，質譜掃描每個色譜峰得到質譜圖，所得質譜信息經計算機用標準NIST08質譜圖數據庫確定香氣物質組分種類。用色譜峰面積歸一化法進一步確定各物質組分含量。

1.2.3 揮發性單物質的抑菌作用分析 為驗證兩株拮抗菌產生的主要揮發性物質對甘薯黑斑病病原菌的抑菌作用，通過分析兩株拮抗菌共同產生的揮發性代謝產物的測定結果（GC-IMS、GC-MS）以及結合各成分安全性分析和在食品中應用現狀，選擇研究己醛（Hexanal）[23]、2-己酮（2-Hexanone）[24]、乙酸丙酯（Propyl acetate）[25]、2-壬酮（2-Nonanone）[26]，同時在GC-MS測定結果中選擇相對含量較高的物質，并根據各成分安全性、實際應用和購買情況，選擇研究異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）[27]、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）[28]、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）[29]，因此購買以上7種揮發性物質純品分析其對病原菌的抑制情況，平板對扣法對揮發性物質進行抑菌效果的檢測。在NA平板培養基中央放置直徑為5 mm的無菌濾紙片，分別滴加20 μL的七種物質（對照不滴加試劑），迅速與放置有直徑8 mm甘薯長喙殼菌菌餅的PDA平板培養基對扣，封口膜密封。每個處理重復三次。28 ℃下培養96 h，每天觀察并測量病原菌的菌落直徑，并計算抑菌率[30-31]。

1.2.4 揮發性混合物質的抑菌作用分析 將對甘薯黑斑病病原菌有較強抑菌作用的揮發性物質己醛和2-壬酮按照1:1比例混合。在PDA平板培養基上放置直徑為8 mm的甘薯長喙殼菌菌餅，在另一個NA平板培養基上放置直徑5 mm的無菌濾紙片，分別滴加50 μL不同濃度的揮發性混合物質，濃度設定為0、100、200、1000 μL/L，將兩平板對扣，封口膜密封，28 ℃下培養72 h，每天觀察并測量病原菌的菌落直徑，每個處理三個重復，試驗重復兩次。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2013整理試驗數據，用SigmaPlot 13.0軟件作圖、計算均值及標準偏差。采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行數據統計分析，用Duncan” s新復極差法進行顯著性（P＜0.05）水平檢驗。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌菌液熏蒸對甘薯黑斑病病斑擴展的影響

如圖1所示，經菌株JK和GK發酵液熏蒸處理后甘薯黑斑病發病時間明顯晚于對照，其中，拮抗菌JK發酵液熏蒸處理的薯塊對病斑的擴展有較強的抑制作用，在處理薯塊15 d后，病斑擴展的抑制率達61.29%；拮抗菌GK發酵液熏蒸薯塊15 d后，病斑擴展的抑制達54.84%。表明兩種拮抗菌菌液中含有抑制甘薯黑斑病的揮發性代謝成分，且顯著（P＜0.05）抑制病原菌的生長。同時大量研究也表明，細菌發酵過程中產生的揮發性成分對病原菌具有抑制作用[13-15]。如Xu等[32]研究表明用Bacillus tequilensisXK29的發酵液熏蒸甘薯后，對于甘薯黑斑病有明顯的抑制作用，與本試驗結果一致。

圖1 菌株JK及GK揮發性代謝產物對甘薯黑斑病病斑擴展的影響Fig.1 Effects of volatile metabolites of strain JK and GK on disease development of black spot inoculated with C. fimbriata

2.2 拮抗菌揮發性抑菌物質的鑒定結果

2.2.1 GC-IMS測定的拮抗菌揮發性代謝產物

2.2.1.1 兩種拮抗菌揮發性代謝產物差異變化 三組樣品的GC-IMS譜圖如圖2所示，整個圖背景為藍色，橫坐標1.0處紅色豎線為RIP峰（反應離子峰，經歸一化處理），RIP峰兩側的每一個點代表一種揮發性有機物。其中顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大，點越大顏色越深表明峰信號越強。總體來說，兩種拮抗菌的揮發性有機物的遷移時間大都集中在1.0～1.5 ms區間內，保留時間在100～300 s區間，兩種樣品的揮發性有機物在氣相保留時間300 s內完成了GC-IMS分離。

圖2 三組樣品氣相色譜離子遷移譜譜圖Fig.2 GC-IMS of three groups of samples

為了進一步比較不同樣品的差異，選取空白NB培養基CK對照為背景參照，其他樣品的譜圖扣減參比，若兩種拮抗菌揮發性代謝產物一致，則扣減后的背景為白色；若濃度高于參比，則扣減后的背景為紅色；若濃度低于參比，則扣減后的背景為藍色。從圖3可以看出以空白培養基作參比時，JK和GK譜圖中的背景顏色為藍色，表明揮發性有機物含量均比培養基中的揮發性有機物少，為更好比較揮發性有機物的變化情況，框選這些揮發性有機物的峰，形成樣品指紋圖譜進行對比。

圖3 三組樣品氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.3 Difference diagram of GC-IMS of three groups of samples

2.2.1.2 兩種拮抗菌中揮發性有機物指紋圖譜對比

由圖4和表1所示，區域A1中標出的物質正辛醇（1-Octanol）、甲基環戊烯醇酮（2-Cyclopenten-1-one-2-hydroxy-3-methyl）、羥基丙酮（Hydroxyacetone）、3-甲基丁醛（3-Methylbutanal）、2-辛酮（2-Octanone）、糠醇（2-Furanmethanol）、4-羥基丁酸內酯（Gammabutyrolactone）、2-甲基吡嗪（2-Methylpyrazine）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（3-Methyl-3-buten-1-ol）、2-甲基丁酸甲酯（Methyl-2-methylbutanoate）、2-甲基丙醛（2-Methylpropanal）等物質僅在培養中存在，在兩株拮抗菌中未發現，可作為培養基的特征標記物，原因可能是被拮抗菌作為營養物質在生長過程中被消耗，或者是拮抗菌生長抑制這些物質的揮發。區域A2中標出的1、8、9、27、32、36（未定性出）等物質在培養基中含量最高，在兩株拮抗菌中含量較少。區域B標出的物質在培養基中未發現，在兩株拮抗菌中存在，但含量不同。區域C中物質為JK的特征揮發性有機物，如丁酸（Butanoic acid）、異戊醇（Isoamyl alcohol）、3-甲基-1-丁醇（3-Methyl-1-butanol）等，在培養基和GK中均未發現。區域D中標出的物質如乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-己酮（2-Hexanone）、己醛（Hexanal）在GK中含量高于對照和JK菌株。由于有些物質在GC-IMS數據庫中未能定性，所以有必要結合GC-MS進行定性。

圖4 通過GC-IMS檢測出的兩種拮抗菌中揮發性有機物指紋圖譜對比Fig.4 Comparison of fingerprints of volatile organic compounds from two antagonistic bacteria by GC-IMS

表1 兩種拮抗菌及NB培養基揮發性有機物定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile organic compounds in two antagonistic and Nutrient Broth

2.2.1.3 兩種拮抗菌中揮發性有機物指紋圖譜主成分分析 根據圖4構建的兩種拮抗菌揮發性產物指紋圖譜，采用Dynamic PCA插件進行PCA處理，比較2種拮抗菌揮發性代謝產物的差異，如圖5所示，培養基和兩種拮抗菌分據PCA圖的兩側，區分非常明顯，兩種拮抗菌差異區分亦非常明顯，分據PCA兩端。

圖5 兩種拮抗菌和NB培養基所產揮發性成分的PCAFig.5 PCA of the volatile compounds from the two antagonistic bacteria and Nutrient Broth

2.2.2 GC-MS測定的拮抗菌揮發性代謝產物 如表2所示，在 GC-MS分析后，對測得的每種化合物依據NIST標準譜庫對比及相對保留值進行定性，去除對照組中含有的物質后，JK和GK所產生的揮發性物質分別為17和9種（其中兩種萃取頭測定出的相同物質，以峰面積大的萃取頭為準），屬于酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質，這與Rajaofera等[14]的報道一致，萎縮芽孢桿菌HAB-5發酵產生的揮發性有機化合物也主要包括烷烴、烯烴、醇類和有機酸。其中十四甲基六硅氧烷（Hexasiloxane, tetradecamethyl-）和2-壬酮（2-Nonanone）是菌株JK和GK揮發性代謝產物中共有的物質，峰面積分別為3.98%和1.22%。

表2 菌株JK和GK揮發性代謝產物的主要成分及相對含量Table 2 Relative content of main volatile components of strain JK and GK

2.3 揮發性單物質的抑菌作用

如表3所示，七種物質中異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）對病原菌的抑制率最高，能完全抑制病原菌的生長，己醛（Hexanal）、2-壬酮（2-Nonanone）和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）的抑菌率分別為93.15%、81.19%和58.62%，對病原菌的抑制效果較好，但是2-己酮（2-Hexanone）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）和乙酸丙酯（Propyl acetate）抑菌作用較弱。

表3 七種揮發性單物質對甘薯黑斑病病原菌的抑制作用Table 3 Antifungal activity of seven compounds against C. fimbriata

2.4 揮發性混合物質的抑菌作用

異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）能完全抑制甘薯黑斑病病原菌的生長，其次是己醛（Hexanal）和2-壬酮（2-Nonanone）。考慮到己醛和2-壬酮的安全性高，常被用作食品添加劑，同時在果蔬病害的防治上已有明顯的效果。此前有研究者發現用己醛熏蒸香蕉果實后，在800 ppm濃度下，香蕉果實的炭疽菌和焦腐病菌兩種病原菌的菌絲生長被完全抑制[23]。同時Romina等[26]發現2-壬酮能明顯抑制灰霉病菌的生長。因此結合安全性和實際應用效果選擇將己醛和2-壬酮兩者混合后探究其抑菌效果。如圖6所示，當混合液濃度為100、200、1000 μL/L時對甘薯黑斑病病原菌的生長均有很強的抑制作用。在培養72 h后，100 μL/L的混合物濃度抑菌率達到70%，濃度為200 μL/L時，菌斑直徑不再增加，病原菌停止生長。

圖6 不同濃度的混合揮發性物質對甘薯黑斑病病原菌生長的影響Fig.6 Inhibition of different concentrations of the artificial mixture of volatile metabolites on the growth of C. fimbriata

3 討論與結論

與化學殺菌劑相比較，生物防治被認為是一種安全高效的防治手段。Bu等[33]發現枯草芽孢桿菌L1-21對番茄的灰霉病有明顯的抑制作用。Mu等[34]的研究結果表明，從土壤中分離到的萎縮芽孢桿菌J-1可以有效控制蘋果輪紋病。本研究從甘薯表面及甘薯地土壤中分離到兩株對甘薯黑斑病有較強抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK，可產生揮發性抑菌成分。

許多研究發現，芽孢桿菌在發酵過程中產生的揮發性代謝產物能夠作用于果蔬，抑制病原菌的生長，延緩果蔬發病。Zhang等[35]發現枯草芽孢桿菌ZD01發酵產生的6-甲基-庚酮對馬鈴薯上的茄鏈格孢菌有明顯抑制作用。Xu等[32]發現特基拉芽孢桿菌發酵能產生21中揮發性化合物，其中異戊酸、異丁酸和2-甲基丁酸能有效抑制甘薯長喙殼菌的生長。本研究分別用JK和GK發酵液熏蒸處理甘薯果實后，發現熏蒸后出現病斑的時間晚于對照，同時期內病斑直徑顯著小于對照，說明兩株拮抗菌發酵其產生的揮發性代謝產物可有效的抑制黑斑病，延緩甘薯薯塊發病。通過GC-IMS和GC-MS對菌株JK和GK的揮發性物質進行檢測，發現揮發性物質主要有酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質。經過平板抑菌實驗發現己醛、2-壬酮、異辛醇和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯是抑制黑斑病的主要氣體成分，己醛和2-壬酮對黑斑病的抑制率分別為93.15%和81.19%，將兩者按照1:1的比例混合后，混合液濃度為100 μL/L時，對甘薯黑斑病病原菌菌絲生長的抑制率達到70%，濃度高于200 μL/L時，菌絲停止生長。

芽孢桿菌在發酵過程中除了可以產生具有抑菌作用的揮發性代謝產物之外，發酵液中的代謝產物對病原菌也有抑制作用。汪靜杰等[36]研究發現篩選到的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌的發酵濾液中含有明顯抑制球孢白僵菌的物質，經提取鑒定后，確定有效成分為芬枯草菌素和伊枯草菌素。Zhang等[37]發現從番茄根際中分離到的解淀粉芽孢桿菌對多種植物病原菌有廣譜抑菌性，鑒定抑菌物質為伊枯草素和芬枯草菌素，說明發酵菌液中含有能抑制真菌生長的物質。因此在后續研究中可以對分離到的兩株拮抗菌中的活性物質進行進一步研究。

本研究中的兩株拮抗菌生長所需營養簡單，繁殖速度快，產生的揮發代謝產物對于黑斑病有較強的抑制效果，在甘薯采后病害控制中有一定的應用前景，為減少化學殺菌劑的使用提供了新途徑。