超聲及酶解處理的羅望子木葡聚糖流變特性研究

廖秋冬，曹 瀟，陳思謙, ，王 凱

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.東莞理工學院化學工程與能源技術學院，東莞理工科技創新研究院，中國輕工業健康食品開發與營養調控重點實驗室，廣東東莞 523808）

羅望子（Tamarindus indicaL.），又名酸角，是一種蘇木科的大型喬木，主要以野生或半野生狀態分布在我國的南方地區[1]。羅望子種子中的木葡聚糖（Xyloglucan，XG）含量高達60%[2]，是木葡聚糖最豐富的來源之一[3]。木葡聚糖是高等植物初生細胞壁中的一種半纖維素多糖[4-5]。羅望子木葡聚糖的化學結構由β-1,4-D-葡聚糖連接的主鏈及在D-吡喃葡萄糖殘基的O-6位置部分被α-D-木糖取代的支鏈組成，且支鏈中的部分木糖中的O-2位置被β-D-半乳糖進一步取代[6]，其半乳糖分子含量約為13.2%[7]。木葡聚糖的分子組成及其微觀結構賦予了其獨特的化學和物理性能[8]，如良好的熱穩定性、耐酸堿、高黏度等特點，在食品工業中有廣泛的應用[9]。羅望子種子中提取的木葡聚糖是FDA批準的生物聚合物，可用作食品添加劑[10]，作為穩定劑[11]、增稠劑[12]、膠凝劑[13-14]、乳化劑[15]等改善食品產品的流變等性能。作為增稠劑，木葡聚糖的性能與果膠類似，因而木葡聚糖在制作蛋黃醬、糖果、果凍、增稠醬、冰激凌、果醬等食品過程中可以替代部分果膠[16]。在面團發酵時加入木葡聚糖，可以提高面團的穩定性，并改善面包的柔軟性[17]。此外，木葡聚糖具有優異的成膜性，可以用來制備生物可降解薄膜，且制成的薄膜具有較高的強度、硬度和阻氧性能[18]。Indira等[19]用木葡聚糖作為填充劑制備了可完全生物降解的納米復合膜，這種納米膜具有優異的拉伸和抗菌性能，可應用于食品包裝領域。

天然狀態下，木葡聚糖在水中的溶解性較差，同時自身不能形成凝膠，限制了其應用范圍。同時，木葡聚糖等生物多糖的許多功能特性受其分子質量和分子結構影響較大。比如，在醫療和化妝品領域中，低分子量的多糖由于較為容易在生物組織中擴散，而比高分子量的多糖具有更好的優勢[20]。此外，對多糖分子支鏈和糖苷結構的修飾可以獲得懸浮性、親水性或穩定性更好的膠體產品[21]。因此，可以對木葡聚糖進行改性處理以制備出具有不同流變特性的木葡聚糖產品并開發應用到新的領域。多糖的流變性質可以通過對其分子結構的修飾進行調整[22]，往往通過物理、生物、化學等方法進行修飾。超聲波法是常用的物理改性手段，可以快速將多糖分散在稀溶液中。此外，超聲波還被廣泛用于改變多糖相對分子質量、顆粒大小、黏度和活化能等物理化學性質[23]。有報道稱，超聲波法可降低木葡聚糖的平均分子量[24]。另一方面，生物改性方法中，常使用半乳糖苷酶去除木葡聚糖支鏈上的半乳糖苷，以獲得具有更高黏彈性的木葡聚糖溶液以形成水凝膠。Kochumalayil等[25]用β-半乳糖苷酶酶解木葡聚糖去除部分半乳糖側鏈來制備薄膜，改性后的木葡聚糖樣品在高濕度條件下的透氧率降低且彈性模量顯著提高。Brun-Graeppi等[26]使用β-半乳糖苷酶酶解羅望子木葡聚糖發現，隨著半乳糖去除率的增加，木葡聚糖溶膠-凝膠的轉變溫度降低。然而，目前尚未有報道系統討論超聲和酶解處理木葡聚糖后微觀結構及流變特性的變化。

本研究討論并比較了超聲及酶解處理的木葡聚糖分子在不同溫度、剪切速率和應變振幅/頻率下的黏度和剪切模量等流變特性。結合凝膠色譜-多角度激光光散射（SEC-MALS）、動態激光光散射儀和掃描電子顯微鏡等手段，分析了木葡聚糖在超聲及酶解處理后的分子量分布、粒徑大小和微觀形貌特征。此研究對羅望子木葡聚糖分子結構物理及生物修飾方法提供了一定經驗，有利于進一步開發木葡聚糖作為增稠劑等食品添加劑的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅望子木葡聚糖（純度95%）、β-半乳糖苷酶（4000 U/mL） 愛爾蘭Megazyme公司；醋酸鈉 天津市大茂化學試劑廠；冰醋酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MR Hei-Tec 磁力攪拌加熱器 德國Heidolph公司；MCR702流變儀 奧地利Anton Paar公司；EM-30 PLUS臺式掃描電鏡 韓國Coxem公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DynaProNanoStar動態激光光散射儀、SEC-MALS多角度激光光散射凝膠色譜聯用儀 美國Wyatt公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲處理木葡聚糖 參考Talantikite等[27]的方法，適當修改。使用超聲波細胞破碎機，以直徑6 mm的超聲波變幅桿，功率為180 W條件下對濃度為1%（w/w）的木葡聚糖溶液進行超聲處理，分別制備超聲處理1.5和2.5 h的木葡聚糖溶液。

1.2.2 酶解木葡聚糖的制備 將木葡聚糖在室溫（26 ℃）下使用磁力攪拌器以600 r/min的轉速溶解于去離子水中，配制成1%（w/w）的溶液。根據Brun-Graeppi等[26]的方法，用半乳糖苷酶對木葡聚糖進行酶解。用醋酸鈉緩沖液將樣品的pH調至5.0。半乳糖苷酶的酶量為3.7 U/mL，在50 ℃下進行酶解反應，分別反應16、32、48 h，然后將樣品在100 ℃下加熱20 min使酶失活。

1.2.3 木葡聚糖流變特性測試 使用應變控制型旋轉流變儀測定原木葡聚糖及經過處理的木葡聚糖的流變特性。使用25 mm不銹鋼平行板對樣品進行測試，測量間隙設為0.1 mm。裝樣時，將樣品適量滴加到流變儀的下平板的中心區域上，并平衡5 min。將硅油添加于樣品圓形幾何形狀的周圍，以減少水分蒸發。每種樣品進行3次平行實驗以獲取算數平均值和標準差。

1.2.3.1 旋轉模式-恒定剪切速率下的溫度掃描 參考蘇攀峰等[28]的方法，適當修改。剪切速率固定為50 s-1，將溫度由5 ℃升至60 ℃，升溫速率2 ℃/min，記錄剪切黏度和溫度的關系。

1.2.3.2 旋轉模式-恒定溫度下的黏度曲線 參考陳發河等[29]的方法，適當修改。在0.1～100 s-1范圍以對數增加的剪切速率進行測試，溫度恒定為50 ℃，記錄未處理木葡聚糖、超聲處理的木葡聚糖和酶解木葡聚糖在不同剪切速率下的剪切黏度。

1.2.3.3 振蕩模式-溫度掃描 參考Busato等[30]的方法，稍作修改，溫度掃描范圍為5～60 ℃，溫度梯度為1 ℃/min，振幅和頻率分別固定在0.1%和1 Hz（線性黏彈區內），記錄儲存（彈性）模量（G” ）和損耗（黏性）模量（G” ” ）隨溫度的變化，同時記錄損耗因子（tanδ）。

1.2.3.4 振蕩模式-振幅掃描 分別在5、37和50 ℃的溫度下，以1 Hz的恒定頻率，將剪切應變振幅以對數增加方式從0.1%增加到100%對樣品進行振幅掃描，記錄儲能模量（G” ）和損耗模量（G” ” ）。

1.2.3.5 振蕩模式-頻率掃描 分別在5、37和50 ℃溫度下，以0.1%的固定振幅，使頻率從0.1 Hz增加到10 Hz，記錄不同頻率下的儲能模量（G” ）和損耗模量（G” ” ）。

1.2.4 木葡聚糖分子量測定 使用SEC-MALS測定未處理和超聲及酶解的木葡聚糖的相對分子質量。色譜柱為SB-805HQ（日本Shodex公司），檢測器為示差折光檢測器與激光檢測器聯用。流動相為0.02%（w/w）NaCl水溶液，流速為0.5 mL/min，進樣量為200 μL。重均分子量（MW）通過使用Zimm模型[31]的線性擬合計算得到：

式中：K是一個實驗常數，取決與光的波長和多糖的折射率增量；Rθ是用來確定大分子在θ角上散射的光與入射光的完整性之比的瑞利比率；B是第二維利系數，單位為mL·mol·g-2；Rg是旋轉半徑，單位為cm。

1.2.5 木葡聚糖粒徑測定 使用動態激光光散射儀測量原木葡聚糖及經過超聲和酶解處理的木葡聚糖水溶液的平均粒徑，測試溫度為25 ℃。每個樣品進行3次重復實驗。

1.2.6 木葡聚糖微觀結構觀察 為保持處理溫度一致性，所有樣品均在37 ℃的顯微鏡載玻片上固定，用液氮淬火，真空冷凍干燥48 h。然后采用離子濺射儀在10～20 mA的濺射電流下在樣品表面噴金約60 s，最后使用掃描電子顯微鏡進行成像觀察。儀器參數設置如下：加速電壓為5 kV，工作距離為6 mm，放大倍數為500倍。每個樣品選擇至少3個不同的位置拍攝照片。

1.3 數據處理

使用Excel 2019和Wyatt公司ASTRA軟件（版本6.1.1.17）處理數據，并使用Origin Pro 2021 軟件進行繪圖。所有試驗均重復3次，數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 木葡聚糖流變特性分析

2.1.1 旋轉模式-恒定剪切速率-溫度掃描和旋轉模式-恒定溫度-剪切速率掃描 圖1展示了未處理與超聲及酶解處理的木葡聚糖在剪切速率為50 s-1下黏度和溫度的關系（圖1A）以及在溫度為50 ℃時黏度和剪切速率的關系（圖1B）。在剪切速率為50 s-1，溫度5～45 ℃時，經超聲和酶解處理的木葡聚糖的黏度低于未經處理的木葡聚糖，而在同樣條件下，超聲處理的木葡聚糖黏度大于酶解木葡聚糖黏度（圖1A）。但相同處理方法，不同處理時間的樣品黏度差異較小。低溫情況下（5 ℃），原木葡聚糖的黏度為249 mPa·s；而超聲1.5和2.5 h的木葡聚糖黏度分別為105和110 mPa·s；酶解16、32、48 h的木葡聚糖黏度分別為21、23、14 mPa·s。未處理的木葡聚糖的黏度隨溫度升高而大幅下降。而超聲木葡聚糖的黏度也表現出強溫度依賴性，黏度隨溫度下降明顯，從5 ℃到60 ℃下降至約原來黏度的18%。另一方面，酶解木葡聚糖在5～40 ℃范圍內溫度敏感性較低，但在高溫度（40～60 ℃）下出現黏度隨溫度升高而增高的現象。在55 ℃左右，黏度超過了超聲處理木葡聚糖。當固定測試溫度50 ℃，增加剪切速率時，酶解木葡聚糖樣品在近零剪切速率（0.2 s-1）時表現出高于未處理木葡聚糖的表觀黏度，且黏度隨著酶解時間增長而增加。酶解16、32、48 h的木葡聚糖零剪切黏度分別為2079、2746、5018 mPa·s，而原木葡聚糖的零剪切黏度為212 mPa·s。Han等[32]發現使用β-半乳糖苷酶在與本實驗相同的條件下對羅望子木葡聚糖進行酶解，酶解16、32和48 h后半乳糖的脫除率分別約為39%、42%和43%。另一方面，超聲處理降低了木葡聚糖的零剪切黏度，但不同處理時長間的黏度差距較小。超聲1.5和2.5 h的木葡聚糖黏度分別為126和122 mPa·s。隨著剪切速率的增加，所有的樣品都表現出典型高分子溶液的剪切稀化行為，但流動行為有所區別。未處理及超聲的木葡聚糖樣品黏度表現出“下降-平臺期-下降”的三段式剪切稀化行為。但酶解木葡聚糖樣品隨著剪切速率上升表現出黏度持續下降的流動特性，且下降幅度遠高于原木葡聚糖和超聲樣品。

圖1 不同處理方法的木葡聚糖溶液溫度-黏度曲線（A）和剪切速率-黏度曲線（B）Fig.1 Temperature-viscosity curve (A) and shear rate-viscosity curve (B) of XG solution with different treatment methods

在恒定剪切速率下，未處理的木葡聚糖的黏度隨著溫度的升高下降，這與Sims等[33]在研究不同來源的木葡聚糖的流變特性時得出的結論一致。升溫會提升物質能量，分子運動速度加快，分子間接觸時間更短，因此內部摩擦力更小，表觀黏度下降。超聲木葡聚糖符合這一規律，證明超聲處理可能不能改變原木葡聚糖分子間相互作用類型。但超聲的黏度總體出現下降，可能是由于超聲處理降低了木葡聚糖分子的平均分子量，減少了總體內摩擦力。而酶解木葡聚糖分子可能與未處理及超聲處理木葡聚糖具有不同的分子結構，導致了不同的流變行為。酶解的木葡聚糖的高溫增稠性表明分子間運動加劇時，去除半乳糖支鏈的木葡聚糖分子碰撞時發生了更強的結合，這些分子發生聚集產生了更大的摩擦力，導致黏度上升。

在固定溫度，增加剪切速率的條件下，酶解樣品表現出的高零剪切黏度，說明酶解后的木葡聚糖在水溶液中可能有更大的平均粒徑，而超聲樣品的低零剪切黏度表明平均粒徑出現了下降。同時，酶解木葡聚糖的剪切稀化行為相比于原木葡聚糖和超聲木葡聚糖更為明顯，證明原木葡聚糖和超聲處理木葡聚糖的分子量分布較為均勻，同時“三段式”剪切稀化行為表明相互纏繞的長鏈木葡聚糖分子可以在高剪切速率下解纏并取向。而酶解木葡聚糖樣品中分子量分布不均勻，隨剪切速率增加不存在黏度平臺期，說明酶解木葡聚糖分子在高剪切速率下仍然無法完全解纏，分子間結合力較原木葡聚糖和超聲木葡聚糖更高。因剪切過程中涉及到能量的儲存與損耗，應進一步使用振蕩模式分析木葡聚糖分子在超聲和酶解處理后的儲能和損耗模量變化情況。

2.1.2 振蕩模式-溫度、振幅、頻率掃描 由圖2A可知，原木葡聚糖和超聲處理的木葡聚糖在振蕩模式下的溫度敏感性較低。原木葡聚糖的損耗因子（tanδ）維持在1左右，呈現出一種介乎液體和固體之間的弱凝膠狀態。而超聲處理的木葡聚糖在5～60 ℃范圍內的tanδ遠大于1，呈現出較強的液體流動特征。酶解16和32 h的木葡聚糖樣品在5～27 ℃的條件下同樣表現出黏性為主的流變特性，而在接近27 ℃時tanδ降低到1，達到凝膠點（圖2B）。而在溫度超過27 ℃之后，tanδ保持在1以下且彈性模量逐漸升高，凝膠強度隨溫度升高逐漸增強，在約45 ℃后趨于穩定。而酶解時間48 h的樣品在5～60 ℃溫度范圍內，tanδ始終小于1，說明酶解48 h的木葡聚糖樣品在更容易形成凝膠。Miyazakid等[34]的研究中將木葡聚糖用β-半乳糖苷酶酶解16 h后木葡聚糖形成凝膠的溫度為27 ℃，與本文所得結果一致。而經半乳糖苷酶酶解的木葡聚糖隨著酶解時間的增加，轉變成凝膠的溫度降低。這一結論與Brun-Graeppi等[26]對在同樣條件下酶解羅望子木葡聚糖形成的水凝膠的溶膠-凝膠轉變研究得出的結論一致。

圖2 不同處理方法的木葡聚糖溶液溫度掃描流變測試圖Fig.2 XG solution in a temperature-sweep rheological test with different treatment methods

圖3展示了原木葡聚糖和經超聲及酶解處理木葡聚糖在50 ℃的恒定溫度下，振蕩模式下的振幅和頻率掃描結果。可以看出酶解木葡聚糖是彈性為主體的黏彈性凝膠，振幅掃描中酶解木葡聚糖線性黏彈區的應變振幅上限約為0.3%，同時在10%的應變振幅下出現了G” 過沖超過G” 的Payne效應線現象[35]。原木葡聚糖和超聲處理的木葡聚糖的損耗模量G” 始終大于儲能模量G” ，樣品呈現液體特性。在應變到達1%時，樣品進入非線性黏彈區且G” 增大并接近G” ，彈性增強，證明在高剪切應變下原本呈溶液狀態的木葡聚糖表現出一定彈性。酶解木葡聚糖的復數模量G*顯著（P＜0.05）高于未處理和超聲的木葡聚糖樣品（圖3A2），說明酶解作用增強了木葡聚糖分子間的相互作用，進而增加了凝膠剛度，這與旋轉模式實驗結果一致。而在頻率掃描中，酶解木葡聚糖在1 Hz以內的低頻條件下表現出弱凝膠的線性黏彈性，但在頻率高于1 Hz后損耗模量G” 出現上升，說明凝膠在高頻剪切下易發生崩解而流動特性增強。而原木葡聚糖和超聲處理木葡聚糖在0.1～10 Hz的頻率范圍，模量對頻率的依賴性較大。隨著頻率的增大，G” 、G” 和G*均增大，始終表現出明顯的液體特征。

圖3 不同處理方法的木葡聚糖溶液在50 ℃的振幅掃描（A）和頻率掃描（B）Fig.3 Rheological properties of XG solution with different treatment methods at 50 ℃in amplitude (A) and frequency sweep (B)

木葡聚糖骨架內的半乳糖殘基是親水性的，而骨架的其余部分本質上是疏水的。酶解的樣品因去除了部分半乳糖，隨著溫度的升高分子碰撞加劇，更多的疏水結構域聚集在一起，致木葡聚糖之間的相互作用力增強使其形成凝膠[36]。振蕩模式-溫度掃描的結果與旋轉模式結果一致，證明酶解木葡聚糖在加溫過程中有更強的儲能過程。此儲能過程大致可分為三個階段，第一階段（5～27 ℃）的黏性為主的無序流動階段，第二階段（27～45 ℃）的凝膠網絡逐漸形成的階段，和第三階段（45～60 ℃）凝膠狀態趨于穩定的階段。而通過對凝膠已經成型后的振幅掃描和頻率掃描分析可知，1%濃度的脫半乳糖苷木葡聚糖水凝膠為一種弱凝膠，通過疏水鍵形成的分子網絡易在高剪切應變和高振蕩頻率下發生崩解而表現出液體特性。而超聲處理的木葡聚糖樣品的在振蕩模式下的流變行為與原木葡聚糖類似，證明超聲處理并不能達到酶解處理增強木葡聚糖分子間的作用力的效果。

2.2 超聲和酶解處理對木葡聚糖平均分子質量和粒徑的影響

從表1可知原木葡聚糖的重均分子量為885 kDa，這與先前報道結果接近[27]。木葡聚糖的重均分子量隨超聲處理時長的增加而減少。超聲1.5 h和超聲2.5 h的木葡聚糖重均分子量分別為780 和520 kDa。且超聲處理樣品均勻性較好，SEC-MALS分析結果顯示只存在出峰時間為12 min的一個信號峰（圖4A）。而酶解木葡聚糖為一種高分子量（4591～12173 kDa）和低分子量（101～478 kDa）物質組成的混合物，出峰時間分別為9～11 min和14～18 min。低分子量占80%以上（酶解16、32和 48 h分別占比95%、93%、和85%）。且酶解樣品在保留時間為16～23 min的范圍內出現了饅頭狀峰，證明溶液中可能存在一定的高分子間的糾纏。從箱線圖4B可以看出，動態光散射的結果表明，原木葡聚糖溶液的平均粒徑為266 nm。超聲降低了木葡聚糖的平均粒徑，經1.5和2.5 h超聲時長處理的木葡聚糖分子粒徑分別降低到252和135 nm。而酶解反而增大了木葡聚糖的平均粒徑，經16、32、48 h酶解的木葡聚糖分子粒徑分別為734、1644和1669 nm。但由箱線圖的數據分布可以看出，酶解木葡聚糖樣品的粒徑測量整體誤差較大，進一步說明了酶解后增加的木葡聚糖分子間疏水作用力造成了分子的團聚，溶液中出現部分大顆粒物質，降低了光散射的測量準確性，這些結果與黏度及剪切模量測試的結果一致。

表1 原木葡聚糖及酶解和超聲處理后的木葡聚糖分子量Table 1 Molecular weight of XG with different treatment methods

圖4 不同處理方法的木葡聚糖的GPC洗脫圖譜（A）和粒徑箱式圖（B）Fig.4 GPC elution atlas (A) and particle size box-diagram (B)of XG with different treatment methods

2.3 超聲及酶解后的木葡聚糖的微觀形貌特征

使用掃描電子顯微鏡觀察了未處理、超聲及酶解后的木葡聚糖的微觀形貌特征。從圖5可以看出，原木葡聚糖（圖5A）和超聲的樣品（圖5B～圖5C）形貌區別不大，所有木葡聚糖樣品都呈現出多孔狀網絡結構，而酶解時間越長的木葡聚糖樣品，形成的孔洞越多（圖5D～圖5F）。Nisbet等[37]研究也發現將2%（w/w）木葡聚糖酶解，在37 ℃下凝膠化后冷凍干燥，樣品在掃描電鏡中顯示凝膠結構出現崩塌。可能的原因是48 h的酶解樣品由于分子成膠性強，分子網絡持水性能更好，因此在凍干過程中由于水的升華更容易形成塌陷，從而形成了更為疏松的網絡結構；而16 h的樣品，分子間作用力相對較小，因此在凍干后大尺寸孔洞較少?？傮w而言，酶解的樣品并未與原木葡聚糖及超聲木葡聚糖在微觀形態上有較大的區別。原因可能是木葡聚糖的總體黏彈性較弱，在凍干過程中導致木葡聚糖分子脫水收縮，造成原有結構的破壞。

圖5 不同處理的木葡聚糖的掃描電子顯微鏡照片Fig.5 Scanning electron microscopy of XG with different treatment methods

3 結論

本研究討論了超聲及酶解處理的羅望子木葡聚糖的流變性能及微觀結構特征。結果表明通過半乳糖苷酶處理的木葡聚糖分子可以增強分子間相互作用力，導致其平均粒徑增加，從而增強了其剪切黏度和模量，而超聲處理降低了平均分子量和粒徑，但整體流變行為與原木葡聚糖差異不大。此外，經酶解處理的木葡聚糖的剪切模量對溫度表現出較強依賴性，酶解16和32 h的木葡聚糖在溫度為27 ℃左右會形成凝膠，而酶解48 h的木葡聚糖在5～60 ℃范圍內均呈現凝膠狀態。但酶解木葡聚糖凝膠強度較弱，在高頻振蕩條件下易發生崩解而出現流動特性。本研究為改性木葡聚糖材料的研發提供了流變學依據，對木葡聚糖在食品包裝、食品添加劑等領域的深化利用提供了一定意義。