金鯧魚發酵菌株篩選及其生物學特性與風味形成評價

蘇偉明，胡夢杰，沈會連，林琰佳，鄧 旗，劉楚祺，鐘賽意，劉 穎,

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東湛江 524088；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧大連 116034）

金鯧魚（Trachinotus ovatus）學名卵形鯧鯵，常生活于熱帶及溫帶海洋中，其肉質細膩、鮮甜、口感綿延，是一種深受消費者喜愛的海洋魚類。近年來，隨著深海網箱、海洋牧場等技術的不斷推廣與應用，金鯧魚養殖產量逐年快速增加，成為南方沿海規?；a的魚類之一[1]。但同時由于過快地擴張，導致金鯧魚市場供過于求，而且目前的市場銷售以活鮮、冰鮮和冷凍魚等產品為主[2]，行業存在產品種類單一，高附加值深加工產品缺乏等問題，造成利潤嚴重下滑，制約了金鯧魚產業發展的空間。湛江烏石鎮地處雷州半島西南部，是廣東省主要漁港之一，全鎮以漁業為主，其中當地居民用傳統鹽制的發酵的方式，形成具有獨特湛江風味的發酵金锠魚，受到消費者喜愛。

發酵是一種經濟而古老的食品加工與保存方法[3]，通過微生物與食物成分的相互作用及微生物酶的降解作用，產生乳酸、酮類、醛類、醇、烯烴類等物質，賦予發酵產品獨特的風味、口感與色澤[4-6]，Narzary等[7]對18種發酵魚產品的營養成分、風味、滋味、益生性及微生物的組成進行了報道，發現發酵魚中微生物對其營養、風味有重要的影響，同時產生的抑菌物質又延長了產品的保質期。因此，開發以發酵金鯧魚為代表的深加工產品有望成為解決滯銷、行業低迷等問題的有效途徑。但是，利用鹽制或風干方法制備的傳統發酵魚中的微生物是來自于自然富集的，由于受到不同年份、不同季節溫度與濕度的影響，參與發酵的微生物種群不確定，影響其產品質量的穩定性、保質期以及安全食用性[8]。因此，篩選具有良好特性的微生物進行人工接種，對提高與穩定產品質量，縮短發酵時間尤為重要。而用于接種發酵的微生物通常是從傳統發酵產品中分離優質微生物這一策略獲得[9]，Shubham等[10]利用此策略從印度的發酵魚中分離篩選到40株乳酸菌，并發現其中兩株菌具有較好的應用特性。近年來，研究發現植物乳桿菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬等乳酸菌在魚的發酵過程中起到了關鍵的作用[11-12]。另外，田國軍等[13]成功地從自然發酵的臘魚中分離到1株優質乳酸菌，并接種到新鮮的臘魚中進行發酵，其產品的風味和質量均得到了明顯的改善。Barbara等[14]發現，乳桿菌屬用于魚發酵香腸生產中，有效減少了發酵時間?？傊?，隨著人工接種發酵技術的不斷成熟，在食品發酵中使用發酵劑進行定向接種已成為提高加工速度和產品質量的重要手段[15]。

針對傳統方法制備的發酵魚微生物種群結構的不確定性，導致產品質量不穩定這一問題，本研究以廣東湛江烏石鎮傳統方法制備的優質發酵金鯧魚為材料，從中分離篩選出適合作為發酵劑的微生物菌種，并對分離菌株的生物學特性及其形成的風味進行評價，以期為實現定向接種，人工控制發酵生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統發酵金鯧魚 新鮮優質，來自于廣東湛江烏石鎮，每條400 g左右；金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC29213）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC35218） 均購自廣東省微生物研究所；MRS肉湯、MRS培養基、營養肉湯（NB）、營養瓊脂（NA） 青島海博生物技術公司；Mighty Amp DNA Polymerase Ver.2 寶生物工程有限公司；16S rRNA細菌通用引物27F：5” -AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3” ，1492R：5” -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3” 上海生工生物技術有限公司合成。

CFX96 Touch型實時熒光定量PCR儀、Gel Doc XR+型凝膠成像儀 美國BIO-RAD公司；PEN3型電子鼻 德國AIRSENSE公司；SA402B型電子舌 日本INSENT公司；Varioskan Flash型酶標儀美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵菌株的篩選 用無菌水沖洗掉發酵金锠魚表面的雜質，瀝干水之后，用滅菌剪子剪碎，稱取25 g加到無菌均質袋中，再加入pH7.2滅菌的PBS 225 mL，均質30 s后，吸取0.1 mL均勻涂布于MRS培養基中，30 ℃培養48～72 h。挑取不同形態特征的菌落，反復純化，直至獲得純的分離株。

參照文獻[16]，篩選具備過氧化氫酶實驗呈陽性、發酵葡萄糖產酸，但不產生生物胺、不產氣，具有一定的耐鹽性，并有良好的抗菌活性菌株作為潛在發酵菌株?？咕钚詼y定采用牛津杯法[17]，其它指標測定采用《常見細菌系統鑒定手冊》描述方法[18]。

1.2.2 發酵菌株的16S rRNA鑒定 分別以27F、1492R為正、反向引物，使用MightyAmp DNA聚合酶對發酵菌株進行菌落PCR，PCR體系與反應條件按照Lu等[19]的方法。再將目的PCR產物寄送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。根據測得的16S rRNA基因序列，從EzBioCloud數據庫進行同源性搜索，下載相似性高的模式菌株的相應基因序列[20]，并用MEGA5.1建立系統發育樹。

1.2.3 溫度對發酵菌株生長的影響 挑取兩環發酵菌株，接種于50 mL MRS液體中，30 ℃靜置培養18 h，作為發酵菌株的種子液，再將種子液按3%接至MRS液體中，混勻后分別置于20、25、30 ℃培養28 h，且每間隔2 h測定發酵液的OD600nm[21]，繪制生長曲線，評價溫度對兩株發酵菌的影響。

1.2.4 pH對發酵菌株生長的影響 將1.2.3中的發酵菌株的種子液按3%的接種量分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的MRS液體中，30 ℃靜置培養24 h后，測定發酵液OD600nm值[22]，繪制生長曲線，評價pH對兩株發酵菌的影響。

1.2.5 發酵菌株產酸能力測定 按3%接種量將種子液接種于100 mL的MRS液體中，30 ℃靜置培養24 h，每間隔4 h取樣，測定發酵液的pH[23]。

1.2.6 發酵菌株抗菌活性的測定 挑取兩環S.aureus與E.coli分別接種于NB中，37 ℃搖床中培養16～20 h，然后將兩種指示菌的菌液濃度稀釋至106CFU/mL，再將指示菌的稀釋液按1:100的比例加到55 ℃的NB中，混勻后趁未凝固前快速倒入擺放有滅過菌的牛津杯培養皿中，待凝固后拔出牛津杯。接著吸取200 μL發酵菌上清液加到杯孔中，37 ℃靜止培養18 h，觀察是否出現抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑[24]。同時，以生理鹽水代替發酵上清液做空白對照。

1.2.7 發酵菌株發酵液的電子鼻測定 將1.2.3中發酵菌的種子液按3%的接種量接于MRS液體中，30 ℃靜止培養24 h，再量取發酵液20 mL于頂空瓶中，靜置30 min后進行電子鼻檢測，測定條件為：頂空時間20 min，樣品及載氣流速均為300 mL/min，傳感器自清洗時間60 s，樣品測試時間60 s，數據采集間隔為1 s，PEN3電子鼻傳感器對不同成份敏感性能描述見表1。

表1 PEN3型電子鼻傳感器描述Table 1 Description of PEN3 electronic nose sensor performance

1.2.8 發酵菌株發酵液的電子舌測定 將1.2.7中得到的菌株發酵液稀釋5倍，在4 ℃下，以3000 r/min離心20 min，收集上清液過濾，吸收100 mL上清濾液裝入專用燒杯中，進行電子舌的檢測。電子舌AAE、CT0、CA0、C00和AE1傳感器的響應特性分別為鮮味、咸味、酸味、苦味和澀味。在測定前，所有傳感器先放在參比溶液（0.30 mmol/L酒石酸和30.00 mmol/L氯化鉀混合溶液）中活化24 h，再裝機進行自檢至信號穩定，每個樣品做4次循環，取后3次結果，并對味覺特征進行分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 發酵菌株的確定

從傳統發酵金鯧魚中分離純化到38株菌，通過發酵菌株篩選實驗，菌株zh-b與菌株zh-f符合發酵菌株篩選標準[16]，確定為潛在發酵菌。在MRS培養基上，菌株zh-f菌落呈圓形，色白，細密，顯微形態為桿狀（圖1A、圖1B）；菌株zh-b在MRS培養基的菌落呈圓形，乳白色，凸起，邊緣整齊，不透明，顯微形態為球狀（圖1C、圖1D）。Samarjit等[12]也從印度曼尼普人制備的傳統發酵魚中分離到46株形態不同的菌株，傳統發酵魚已成為分離用于發酵微生物的重要來源。

圖1 兩株菌菌落與顯微形態圖（100×）Fig.1 Colony and micromorphology of the two strains (100×)

2.2 發酵菌株的16S rDNA鑒定

將菌株zh-b與菌株zh-f的16S rRNA序列與標準菌株進行比對分析，發現菌株zh-b與模式菌株Pediococcus pentosaceusDSM 20336相似性最高，相似率為99.26%，而菌株zh-f與模式菌株Lactobacillus plantarumaATCC 14917相似性最高，相似率為99.11%，并用MEGA 5.1軟件構建系統發育樹（圖2）。結合形態鑒定及16S rRNA序列分析，菌株zh-b與zh-f分別鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。從印尼的發酵魚中也分離到了L.plantaruma與P.pentosaceus[25]，而譚汝城等[21]不僅從自然發酵魚鲊中分離到L.plantaruma與P.pentosaceus，而且又將其接種于新鮮魚中進行發酵，并與自然發酵魚的化學指標和感官品質進行比較，結果表明，接種發酵可以改善魚鲊游離氨基酸的組成，并有效提高了魚鲊的感官品質。

圖2 兩株發酵的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of two strain

2.3 溫度對發酵菌株生長的影響

圖3為兩株發酵菌株在20、25和30 ℃的生長曲線，從圖中可以看出，在30 h內兩株菌的OD600隨著培養時間的延長而不斷升高，并逐漸趨于平穩，說明菌數隨著培養時間的延長而不斷提高，并達到穩定期。其中，菌株戊糖片球菌zh-b（圖3A）菌液濃度在同一培養時間20 ℃生長最好，其次是30與25 ℃。而植物乳桿菌zh-f（圖3B）是30 ℃菌液濃度最高，其次是25與20 ℃。

圖3 兩株發酵菌在不同溫度下的生長曲線Fig.3 Growth curve of two strains at different temperatures

通過比較分析，兩株菌混合發酵液的最適發酵溫度確定為30 ℃，從生長曲線出現平穩時間分析，確定兩株最適發酵時間為16 h。

2.4 pH對發酵菌株的生長影響

圖4為兩株菌在不同pH培養條件下的生長曲線，其中戊糖片球菌的OD600曲線在pH3～5區間的OD600值呈上升趨勢，并在pH5時達到最大值0.45，但在pH6時，OD600出現微小低谷。OD600值總體變化幅度小于0.4，即戊糖片球菌zh-b的生長受pH影響不大。而植物乳桿菌zh-f的生長隨著pH的增高，出現了先增大再減小的現象，pH在3～6區間其OD600值隨著pH的增大而增大，且增幅明顯，并在pH6時，OD600達到最大值1.60后，接著OD600開始下降。

圖4 pH對兩株發酵菌的生長影響Fig.4 Effect of pH on the growth of two strains

2.5 發酵菌株產酸能力測定

不同乳酸菌產酸能力存在一定的差異，由圖5可知，zh-b在24 h內產酸能力較弱，僅在前13 h pH有微小的降低后又開始上升。而zh-f在24 h內一直在產酸，尤其在4～13 h pH下降較快，產酸速率最大，說明該階段產酸能力最強，20 h后pH達到3.775趨于平緩，說明植物乳桿菌zh-f將是發酵金鯧魚中產酸的主要貢獻者。

圖5 兩株發酵菌產酸能力的比較Fig.5 Acid production capacity of two strains

2.6 兩株發酵菌的抗菌活性

由表2可知，兩株發酵菌對E. coli和S. aureus均有抗菌活性，其中植物乳桿菌zh-f對兩種指標菌表現出較強的抗菌活性；而戊糖片球菌zh-b對E.coli和S. aureus雖然也對兩株菌有抑菌效果，但不及zh-f的抗菌效果，這可能與植物乳桿菌產酸能力或產生其它抗菌物質有關。

表2 兩株發酵菌株抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of fermentation strains

2.7 發酵菌株的電子鼻測定

用AIRSENSE PEN3型電子鼻對兩株菌發酵液的氣味成分進行測定，根據響應值繪制雷達圖（圖6）。通過比較發現，戊糖片球菌zh-b和植物乳桿菌zh-f菌株發酵液均含有甲基類（W1S）、硫化物（W1W）、氮氧化合物（W5S）和有機芳香硫化物（W2W）4種相同的香氣成分，但zh-b的響應值明顯高于zh-f，另外還產生了醇類或醛酮類（W2S）成分。其中，戊糖片球菌發酵液中的主要香氣成分W1S、W1W、W5S、W2S、W2W的響應值依次是64.10、57.98、44.75、40.22和19.93，其他傳感器測得的響應值均低于2，香氣成分不明顯。而zh-f發酵液中主要香氣成分硫化物（W1W）、氮氧化合物（W5S）、有機芳香硫化物（W2W）、甲基類（W1S）的響應值分別為34.11、10.68、8.96和5.50，其他傳感器W2S、W3S、W6S、W5S、W3C和W1C，響應值均低于2，香氣成分不明顯。分析表明，戊糖片球菌zh-b是發酵金鯧魚香氣成分的主要貢獻者。Shen等[26]采用相關網絡模型預測了關鍵微生物與風味形成存在明顯的關系，采用美國Isenso公司的iNose電子鼻檢測植物乳桿菌、干酪乳桿菌及戊糖片球菌混合菌制備的發酵帶魚，發現發酵過程中形成了氮氧化合物、有機硫化物，萜類、酯類、甲基類以及無機硫化物風味物質[27]。

圖6 兩株發酵菌的電子鼻雷達圖Fig.6 Electronic nose radar map of two strains

2.8 發酵菌株的電子舌測定

SA402B電子舌傳感器酸味和咸味對應傳感器的無味點下限分別為-13和-6，其他味覺指標對應傳感器的無味點下限均為0，按該電子舌的規定大于無味點的味覺指標，即可作為評價對象。根據電子舌對兩株菌味覺響應值的測定，繪制滋味雷達圖（圖7）。從圖中可以看出，兩株菌的咸味、澀味、苦回味及澀回味的測定值均不大于無味點下限值，表明兩株不產生對應的味道。對于酸味，戊糖片球菌酸味值為-29.5，小于-13，說明該菌不產生酸味，而植物乳酸菌的酸味值為-3.58，明顯大于-13，說明該菌具有較強的產酸能力，這與2.5的結果一致。對于鮮味、鮮回味，兩株菌的響應值均大于無味點下限，具有產生鮮味、鮮回味的能力，其中，戊糖片球菌的味值分別為14.32、6.64，高于植物乳桿菌產生鮮味、鮮回味（3.20、2.90）。另外，兩株菌也產生非常少量的苦味（4.74與1.58）。不同的微生物發酵產品的味覺也存在差異，將清酒乳桿菌接種到鰳魚中進行固態發酵，采用法國阿爾法莫斯公司的ASTREE II電子舌對味道進行測定，檢測到發酵鰳魚中的酸味、復合味1、復合味2及鮮味比未接種的對照組顯著[28]，說明微生物在發酵過程中對味覺的形成影響較大。

圖7 兩株菌的電子舌雷達圖Fig.7 Electronic tongue radar map of two strains

3 結論

本研究以過氧化氫酶呈陽性、耐鹽性、抗菌性及不產生組胺為評價指標，從湛江傳統發酵金鯧魚中分離篩選出兩株潛在發酵菌株（zh-b和zh-f），經分子生物學鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantaruma），且最適溫度分別為20、30 ℃，最適pH為5、6。兩株菌均具有抗菌活性，但植物乳桿菌zh-f的抗菌活性更好，且產酸能力明顯高于戊糖片球菌zh-b。但zh-b產生的甲基類、硫化物、氮氧化合物、醇類或醛酮類和有機芳香硫化物高于zh-f，而且zh-b產生的鮮味、鮮回味也高于zh-f。本研究從傳統發酵魚中篩選到的兩株發酵菌株，由于具有良好的特性，且風味與滋味有較好的互補性，因此，兩株菌在發酵魚應用中的潛力不容忽視。