豇豆血紅蛋白Lb II在大腸桿菌中的重組表達(dá)條件優(yōu)化、純化與鑒定

劉 萌，王聰睿，劉 波，趙祥忠

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

近年來(lái)，植物基食品大量涌入市場(chǎng)，市場(chǎng)份額占比不斷增加[1]。2019年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）首次批準(zhǔn)了大豆血紅蛋白作為人造肉的著色劑。研究發(fā)現(xiàn)，豆血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和基因序列與牛珠蛋白相似，以豆血紅蛋白作為色素添加劑，在賦予植物肉類(lèi)似牛肉的顏色質(zhì)地的同時(shí)，還具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。血紅素是鐵卟啉化合物，機(jī)體中約有70%的鐵以血紅素的形式存在[3]，且血紅素作為合成膽紅素的必備前體，是制備人工牛黃的重要原料[4]。隨著人們對(duì)血紅蛋白功效的深入研究，血紅素和血紅蛋白肽作為一種良好的補(bǔ)鐵劑已被廣泛應(yīng)用于功能性食品中[5]。

豆血紅蛋白（Leghemoglobin，Lb）是一類(lèi)在與根瘤菌共生的植物結(jié)節(jié)根部中發(fā)現(xiàn)的植物血紅蛋白。1931年豆血紅蛋白首次被發(fā)現(xiàn)存在于豆科植物根瘤中[6]，該蛋白質(zhì)中含有的血紅素可以使根瘤呈現(xiàn)粉紅色，含量約占根瘤細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的30%左右[7]。豆血紅蛋白由一個(gè)血紅素和一條肽鏈組成，經(jīng)分級(jí)提取可以得到兩個(gè)主要成分和兩個(gè)次要成分[8]。與哺乳動(dòng)物血紅蛋白相同，豆血紅蛋白中的輔基血紅素有與氧氣可逆結(jié)合的功能，通過(guò)調(diào)節(jié)根瘤細(xì)胞周?chē)难鯕鉂舛龋S持固氮酶所需的低自由氧濃度，并起到氧緩沖劑的作用。豆血紅蛋白還可通過(guò)氧化磷酸化提供固氮作用所需能量，同時(shí)保護(hù)對(duì)氧氣較敏感的固氮酶，由此保證根瘤固氮作用的正常運(yùn)行[9]，且研究表明根瘤中固氮酶活性與豆血紅蛋白的含量呈正相關(guān)[10-11]。豇豆（Vigna unguiculata）屬雙子葉植物綱、薔薇目，又稱為飯豆和長(zhǎng)豆[12]。豇豆中含有豐富的維生素、微量元素和易于消化吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且豆莢、豆粒味道鮮美，在中國(guó)被廣泛栽培。豇豆根瘤中含有三種豆血紅蛋白（LbⅠ、Lb Ⅱ和Lb Ⅲ），其中以Lb Ⅱ?yàn)橹鳌?/p>

目前已經(jīng)在包括豆科植物在內(nèi)的多種植物中分離出了血紅蛋白，但由于根瘤中血紅蛋白的含量有限，提取成本較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)理想的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵成本低、產(chǎn)量大，是高效生產(chǎn)血紅蛋白的重要方法之一[13]，目前已實(shí)現(xiàn)多種血紅蛋白的異源表達(dá)[14]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多植物血紅蛋白的基因序列已被闡明，為后期通過(guò)基因工程和微生物發(fā)酵生產(chǎn)植物血紅蛋白提供了基礎(chǔ)，并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了大豆[15-18]、黃羽扇豆[19-20]、小麥[21]等植物血紅蛋白的異源表達(dá)。但是豆血紅蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量仍然低，且豇豆血紅蛋白表達(dá)和條件優(yōu)化相關(guān)研究較少。

本研究將Lb Ⅱ的基因序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，連接到表達(dá)載體pET-15b上，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以Lb Ⅱ表達(dá)量為指標(biāo)，IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間為變量?jī)?yōu)化表達(dá)條件，以期提高其表達(dá)量并為進(jìn)一步在其他工程菌中的異源表達(dá)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌Escherichia coliBL21-CodonPlus （DE3）-R-IL、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒pET-15b 本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存；蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂粉等培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 諾維贊生物技術(shù)有限公司；蛋白上樣緩沖液 碧云天生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸、抗生素、牛血清蛋白及SDS-PAGE電泳緩沖液、咪唑、磷酸鈉緩沖液、氯化鈉等藥品 上海生物生工生物工程有限公司；His TrapTMHP親和層析柱 美國(guó)GE公司。

TGL-16M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海精宏設(shè)備有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；JY92-ⅡDN超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；721型紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Infinite F200 Pro型酶標(biāo)儀瑞士Tecan生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET-15b-Lb Ⅱ構(gòu)建 豇豆Lb Ⅱ基因序列（GenBank編號(hào)：U33205.1）經(jīng)在線密碼子優(yōu)化（Codon adaptation tool）軟件（http://www.jcat.de/）優(yōu)化后，由南京金斯瑞生物科技公司合成。將合成的基因序列經(jīng)N末端Nde I和C末端BamH I雙酶切后，通過(guò)DNA連接酶克隆入pET-15b質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pET-15b-Lb Ⅱ，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基（含100 mg/L氨芐青霉素）篩選后獲得重組菌DH5α-pET-15b-Lb Ⅱ，并經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)

1.2.2.1 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pET15b-Lb Ⅱ轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coliBL21-CodonPlus （DE3）-R-IL，使用添加終濃度為100 mg/L氨芐青霉素和100 mg/L氯霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。然后挑取單克隆在終濃度為100 mg/L氨芐青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氧化鈉10.0 g/L，pH7.0）中在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜，獲得重組成功的大腸桿菌。

1.2.2.2 表達(dá)條件的優(yōu)化 將培養(yǎng)過(guò)夜的含重組pET-15b-Lb Ⅱ的大腸桿菌按1:100接種至新的含上述抗生素的LB培養(yǎng)基（1 L）中。上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，OD600達(dá)到約0.8后，分別探究IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響。

1.2.3 重組Lb Ⅱ的收集 將誘導(dǎo)過(guò)的菌液加入離心管中，4 ℃，8000 r/min，離心15 min，收集菌體沉淀，沉淀可見(jiàn)明顯紅色。加入破壁緩沖液（含有20 mmol/L磷酸鈉緩沖液、50 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L咪唑），用槍尖將菌體重懸，于渦旋混合器上充分的均勻混合。冰上超聲工作5 s，間歇5 s，時(shí)間15 min，功率120 W破壁菌體。將裂解溶液于4 ℃、10000 r/min離心15 min，保留上清液，即為重組誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白溶液。

1.2.4 重組血紅蛋白的純化 蛋白鎳柱親和層析首先用10 mL的蒸餾水對(duì)層析柱沖洗排氣，之后加入10 mL Binging buffer（20 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L氯化鈉，pH7.4）平衡鎳柱，然后加入經(jīng)0.22 μL微孔濾膜過(guò)濾后的總蛋白溶液（含有3 mmol/L抗壞血酸）。待蛋白溶液與鎳柱充分結(jié)合后，在鎳柱上可見(jiàn)明顯的紅色柱層。加入10 mL含有終濃度為3 mmol/L抗壞血酸的Binging buffer沖洗，隨后加入10 mL Washing buffer（50 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L氯化鈉，3 mmol/L抗壞血酸，pH7.4）洗去雜蛋白，再加入6 mL Elution buffer（200 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L氯化鈉，3 mmol/L抗壞血酸，pH7.4）收集目的蛋白。

1.2.5 Lb Ⅱ的鑒定與表達(dá)量的測(cè)定 對(duì)得到的重組豇豆血紅蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，并在500～600 nm條件下，對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行可見(jiàn)光吸收光譜測(cè)定。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，利用BSA定量法對(duì)純化后不同誘導(dǎo)表達(dá)條件下的重組蛋白表達(dá)量測(cè)定。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），在595nm波長(zhǎng)下測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00622x+0.49624。

1.2.6 表達(dá)條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 IPTG濃度對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響 加入終濃度為0.05、0.07、0.10、0.15、0.20、0.30 mmol/L的IPTG（isopropyl-β-D-1-thiogalactoside，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），25 ℃誘導(dǎo)16 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.2.6.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響 加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，于16、20、25、30、37 ℃，誘導(dǎo)16 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。

1.2.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響 加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，25 ℃培養(yǎng)10、12、14、16 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以IPTG濃度（mmol/L）、誘導(dǎo)溫度（℃）、誘導(dǎo)時(shí)間（h）為自變量，Lb Ⅱ表達(dá)量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)三因素三水平實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定搖瓶發(fā)酵的最佳條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼Table 1 Experimental factors and level coding of the response surface

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取平均值，采用Origin 2021軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析；采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-15b-Lb II的表達(dá)

2.1.1 Lb II的重組表達(dá) SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明，目的蛋白溶液在約14 kDa出現(xiàn)了明顯的目的條帶，如圖1A所示，與通過(guò)其氨基酸序列所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量一致（https://web.expasy.org/compute_pi/）。重組蛋白溶液與對(duì)照即未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)的蛋白溶液相比，呈現(xiàn)明顯的紅色，如圖1B所示，表明豆血紅蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖1 SDS-PAGE電泳圖（A）及重組菌和對(duì)照菌誘導(dǎo)表達(dá)后收集的蛋白溶液顏色（B）Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis diagram （A） and colors of the protein solution collected after the induced expression of the recombinant and control bacteria （B）

2.1.2 重組Lb Ⅱ的純化 前期研究證明，由于血紅蛋白中包含鐵卟啉結(jié)構(gòu)，可以與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白，所以在540和570 nm左右有特征峰[22]，因此通過(guò)可見(jiàn)光吸收光譜進(jìn)一步確認(rèn)Lb Ⅱ的成功表達(dá)。豆血紅蛋白中的亞鐵離子作為還原劑易被氧化為高鐵離子，從而失去活性，且鎳柱中含有大量金屬離子，還原性較強(qiáng)，可能會(huì)對(duì)二價(jià)鐵離子產(chǎn)生破壞。抗壞血酸是一種抗氧化劑，有還原高鐵血紅蛋白的作用[23-26]，未加入抗壞血酸時(shí)（圖2，曲線2），在570 nm處出現(xiàn)了肩峰，表明在鎳柱層析的過(guò)程中可能破壞了二價(jià)鐵或鐵卟啉的結(jié)構(gòu)，使二價(jià)鐵被改變價(jià)態(tài)[27]，失去了可逆結(jié)合氧氣的活性。加入抗壞血酸進(jìn)行純化后，在540和570 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰（圖2，曲線1），而未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的蛋白溶液無(wú)吸收峰（曲線3），表明轉(zhuǎn)化大腸桿菌后成功表達(dá)出重組Lb Ⅱ蛋白。

圖2 可見(jiàn)光光譜分析Fig.2 Visible spectrophotometry analysis

2.2 重組Lb Ⅱ表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 IPTG濃度對(duì)重組Lb Ⅱ在大腸桿菌BL21中表達(dá)的影響 如圖3所示，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度在0.05～0.1 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，Lb Ⅱ的表達(dá)量逐漸上升，在誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，之后隨著誘導(dǎo)劑濃度的上升表達(dá)量開(kāi)始下降。其原因可能是IPTG具有一定的細(xì)胞毒性，濃度越高，對(duì)細(xì)胞活性越不利[28-30]。采用較低濃度的IPTG可以適當(dāng)?shù)亟档捅磉_(dá)速度，避免因表達(dá)速度過(guò)快或表達(dá)量過(guò)多而產(chǎn)生包涵體。

圖3 不同IPTG濃度的重組蛋白Lb Ⅱ的電泳圖（A）和重組蛋白表達(dá)量變化曲線（B）Fig.3 Electrophoresis diagram (A) and changing curves of the recombinant protein expression (B) of the recombinant protein Lb Ⅱ at different IPTG concentrations

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組Lb Ⅱ在大腸桿菌BL21中表達(dá)的影響 如圖4所示，當(dāng)溫度不斷上升至25 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量也在不斷增加；當(dāng)溫度大于25 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量隨著溫度的升高開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)闇囟扔绊懼?xì)胞活性和可溶性蛋白的表達(dá)。外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可能因過(guò)量表達(dá)，無(wú)法及時(shí)正確折疊而產(chǎn)生包涵體，低溫誘導(dǎo)可以控制表達(dá)速度，增加可溶性蛋白的表達(dá)量，同時(shí)還可以減少較高溫度可能導(dǎo)致的重組蛋白降解[31-32]。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度的重組蛋白Lb Ⅱ的電泳圖（A）和重組蛋白表達(dá)量變化曲線（B）Fig.4 Electrophoresis diagram（A） and changing curves of the recombinant protein expression （B） of the recombinant protein Lb Ⅱ at different induced temperature

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組Lb Ⅱ在大腸桿菌BL21中表達(dá)的影響 結(jié)果如圖5所示。研究顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量不斷增加，在誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到14 h后，表達(dá)量最多；隨后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量不斷減少。可能是由于隨著表達(dá)時(shí)間增長(zhǎng)，目的蛋白在被表達(dá)的同時(shí)被大量降解，同時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生消極影響，出現(xiàn)菌體老化從而使表達(dá)效率降低。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間的重組蛋白Lb Ⅱ的電泳圖（A）和重組蛋白表達(dá)量變化曲線（B）Fig.5 Electrophoresis diagram（A） and changing curves of the recombinant protein expression （B） of the recombinant protein Lb Ⅱ at different induction time

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上可以確定最佳的搖瓶發(fā)酵條件為：IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為25 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為14 h，在此基礎(chǔ)上對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化[33]。該研究以IPTG濃度（A）、誘導(dǎo)溫度（B）、誘導(dǎo)時(shí)間（C）為自變量，Lb Ⅱ表達(dá)量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。

2.3.2 回歸模型的建立與方差分析 利用Design-Expert 11軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行分析，得到了二次多項(xiàng)回歸方程。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface experiment

由表3可知，模型P＜0.0001，表明該模型差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.3951＞0.05，表明該模型失擬項(xiàng)極不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度好；模型決定系數(shù)R2=0.9890，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9749，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果一致性好，誤差小。模型可用于豇豆血紅蛋白Lb Ⅱ表達(dá)量的分析。方程中的一次項(xiàng)A（P＜0.05）顯著，一次項(xiàng)C（P＜0.01）極顯著，說(shuō)明IPTG濃度對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量影響較為明顯，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LbⅡ表達(dá)量的影響極明顯。根據(jù)F值大小可以判斷本實(shí)驗(yàn)采用的三個(gè)因素對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響的主次順序?yàn)椋築（誘導(dǎo)溫度）＜A（IPTG濃度）＜C（誘導(dǎo)時(shí)間）；二次項(xiàng)A2、B2和C2極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

2.3.3 各因素相互作用結(jié)果與分析 利用Design-Expert 11繪制出各因素之間交互作用的三維響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的形狀可以反映出兩兩因素交互作用是否顯著和因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度。響應(yīng)面越陡峭表明因素對(duì)結(jié)果影響越大，交互作用更顯著。等高線呈現(xiàn)橢圓形表明兩個(gè)因素之間交互作用顯著，呈現(xiàn)圓形則表示不顯著。

由圖6所示，Lb Ⅱ表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的上升而呈先增加后下降的趨勢(shì)，等高線呈圓形，表示誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的相互作用不顯著。由圖7可知，Lb Ⅱ表達(dá)量隨著IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。響應(yīng)面曲面坡度相對(duì)陡峭，說(shuō)明IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間交互作用對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響較大。等高線呈橢圓形，說(shuō)明IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間交互作用較顯著。由圖8可知，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度逐漸增大時(shí)Lb Ⅱ表達(dá)量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，且等高線呈圓形，表示誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間之間的交互作用不顯著。

圖6 IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度交互作用對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of IPTG concentration and induced temperature interaction on Lb Ⅱ expression

圖7 IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間交互作用對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration and induction time interaction on Lb Ⅱ expression

圖8 誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間交互作用對(duì)Lb Ⅱ表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of induced temperature and induction time interaction on Lb Ⅱ expression

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程可以預(yù)測(cè)得出最佳的表達(dá)條件為：IPTG濃度為0.110 mmol/L；誘導(dǎo)溫度為24.983 ℃；誘導(dǎo)時(shí)間為14.791 h。在此條件下Lb Ⅱ的表達(dá)量可以達(dá)到7.29 μg/mL。根據(jù)實(shí)際情況，將條件設(shè)定為IPTG濃度：0.11 mmol/L；誘導(dǎo)溫度：25 ℃；誘導(dǎo)時(shí)間：15 h。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，表達(dá)量達(dá)到7.30 ±0.03μg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值較接近，擬合性較好，驗(yàn)證了該模型的有效性。

3 結(jié)論

豆血紅蛋白是一類(lèi)在豆科植物根瘤中廣泛存在的蛋白質(zhì)，對(duì)維持根瘤菌進(jìn)行正常的固氮活動(dòng)有著十分重要的作用。天然的豆血紅蛋白含量少且不易提取，因此可通過(guò)基因工程方法進(jìn)行重組高效表達(dá)，為其作為植物肉的著色劑等應(yīng)用領(lǐng)域提供來(lái)源。迄今，尚未有豇豆來(lái)源血紅蛋白在基因工程菌中重組表達(dá)、條件優(yōu)化及其表達(dá)量的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)成功克隆并構(gòu)建了含有豇豆血紅蛋白Lb Ⅱ基因的pET-15b重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化后得到高效表達(dá)。結(jié)果表明，最優(yōu)表達(dá)條件為在OD600達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，25 ℃誘導(dǎo)14 h。

在設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒時(shí)，在經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的目的序列前端加入His標(biāo)簽，在后期處理粗蛋白提取物時(shí)，可使用操作較簡(jiǎn)單的鎳柱層析進(jìn)行純化。由于血紅蛋白中含有血紅素的特點(diǎn)，易被鎳柱中的金屬離子氧化從而失去活性，故選擇在純化時(shí)加入終濃度為3 mmol/L的抗壞血酸作為抗氧化劑，鎳柱層析得到Lb Ⅱ，并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和紫外可見(jiàn)光分析法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性，確定在大腸桿菌中成功表達(dá)出了豇豆血紅蛋白，最后使用BSA定量法對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行定量，可知在最佳誘導(dǎo)條件（IPTG濃度0.11 mmol/L、誘導(dǎo)溫度25 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間15 h）下，表達(dá)量為7.23 μg/mL。對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化后條件進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)量達(dá)到7.30 μg/mL。本研究為今后使用酵母菌、乳酸菌等其他工程菌表達(dá)豆科血紅蛋白提供了理論參考。