響應面優化超聲波輔助酶法提取湖北海棠葉抗氧化物

呂凱波，張星雨，樂 薇，吳士筠 ，印彩霞

（1.武漢工商學院環境與生物工程學院，湖北武漢 430065；2.中南民族大學生命科學學院，湖北武漢 430074）

湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.） Rehd.]為薔薇科蘋果屬落葉喬木藥食同源植物，生長于海拔50～2900 m的山坡或山谷叢林中，因原產地在湖北而得名。研究表明武陵山區湖北海棠富含黃酮、多酚類等多種物質[1]，能有效清除羥基自由基，具有抗氧化[2]，降血糖、降血脂代謝、抗菌消炎、調節脂質等多種藥理作用[3]，其藥用價值現已被載入《湖北省中藥材質量標準》，2014年衛生部第20號公告批準“湖北海棠（茶海棠）葉”為新食品原料[4]。作為湖北特色植物資源，湖北海棠葉用來沖泡清涼茶解暑降溫歷史悠久，且藥用價值已被證實，產品加工利用及應用前景非常廣闊。

國內外對抗氧化物提取研究較多，主要采用煎煮[5]、溶劑回流法[6]、酶法[7]和超聲波法[8]等提取黃酮、多酚和多糖等活性成分，通過Fenton反應產生的羥基自由基（·OH）的清除作用考察體外抗氧化活性效果。王耀峰等[9]通過采用乙醇浸提法得到湖北海棠葉總黃酮，含量達4.57%；喬孟等[10]利用響應面法優化超聲波提取總黃酮，含量達12.76%。相比于傳統水提和溶劑提取法，超聲波在液體中可以產生機械效應、空化作用及其熱效應等，破壞細胞壁，進而暴露更多的酶促位點[11]，是目前從植物中提取活性成分的重要方法；與酶法結合進行提取，兼具了兩者的優點，不但縮短了提取時間且大大提高了活性成分。目前超聲波輔助酶法在桑葉總黃酮[12]、葡萄皮渣多酚[13]和黃精多糖[14]等提取方面已有報道。動物實驗[15]表明黃酮等類化合物越多其抗氧化活性越好，且采用超聲波輔助酶法提取湖北海棠葉抗氧化物及成分研究未見報道。

本試驗以羥基自由基清除率為指標，采用響應面法優化湖北海棠葉抗氧化物提取工藝，分析對比不同提取工藝下黃酮、多酚和多糖活性成分含量及抗氧化性，為更好的開發利用湖北海棠葉的藥用食用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湖北海棠葉（薔薇科蘋果屬） 產于湖北武陵山區；沒食子酸 質量分數大于98%，批號27975，上海一基實業有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸等 均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司。

KQ-100E超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 金壇市宏華儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機 湘麓離心機儀器有限公司；722E可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 湖北海棠葉的預處理 將湖北海棠葉置于60 ℃烘箱中，烘至恒重之后粉碎（過100目篩），密封于干燥容器中備用。

1.2.2 超聲波輔助酶法提取海棠葉抗氧化物 準確稱取樣品1.00 g，置于50 mL三角瓶中，加入一定體積分數為70%乙醇溶液，在功率為100 W的超聲波清洗器中提取數分鐘，適量加入纖維素酶酶解一段時間，在4200 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.2.3 超聲波-酶法提取工藝的單因素實驗

1.2.3.1 液料比對提取物羥基自由基清除率的影響取1.00 g湖北海棠葉樣品，研究以70%乙醇為溶劑，超聲溫度30 ℃，超聲功率100 W，超聲時間30 min，加纖維素酶量2.5%，酶解時間50 min，液料比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL·g-1條件下，液料比對提取物羥基自由基清除率的影響。

1.2.3.2 超聲時間對提取物羥基自由基清除率的影響 取1.00 g湖北海棠葉樣品，研究以70%乙醇為溶劑，超聲溫度30 ℃，超聲功率100 W，液料比20:1 mL·g-1，加纖維素酶量2.5%，酶解時間50 min，超聲時間10、20、30、40、50 min條件下，超聲時間對提取物羥基自由基清除率的影響。

1.2.3.3 加酶量對提取物羥基自由基清除率的影響取1.00 g湖北海棠葉樣品，研究以70%乙醇為溶劑，超聲溫度30 ℃，超聲功率100 W，液料比20:1 mL·g-1，超聲時間30 min，酶解時間50 min，加纖維素酶量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%條件下，加酶量對提取物羥基自由基清除率的影響。

1.2.3.4 酶解時間對提取物羥基自由基清除率的影響 取1.00 g湖北海棠葉樣品，研究以70%乙醇為溶劑，超聲溫度30 ℃，超聲功率100 W，液料比20:1 mL·g-1，超聲時間30 min，加纖維素酶量2.5%，酶解時間10、30、50、70、90 min條件下，酶解時間對提取物羥基自由基清除率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素基礎上，以羥基自由基清除率為響應值，用響應面分析法分析各因素的交互作用，以確定最佳工藝參數。因素水平設計見表1。

表1 響應面設計因素水平表設計Table 1 Response surface design factor level table design

1.2.5 抗氧化活性及活性成分含量的測定

1.2.5.1 羥基自由基清除率的測定 采用水楊酸法[16]，準確吸取提取液1.00 mL，注入比色管中，依次加入硫酸亞鐵，乙醇-水楊酸，最后加適量過氧化氫搖勻，水浴，在510 nm處測吸光度，計算羥基自由基清除率。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為加入樣品的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2的吸光度。

1.2.5.2 DPPH清除率的測定 利用DPPH自由基與抗氧化劑反應褪色[17]原理，吸取提取液1.00 mL，注入比色管中，加入適量DPPH溶液，在517 nm處測吸光度，室溫避光保存一段時間后在測一次吸光度，計算DPPH清除率。

式中：A0為DPPH液+空白溶液混合液的吸光度；A1為樣品+DPPH混合液的吸光度；A2為樣品+空白溶液混合液的吸光度。

1.2.5.3 黃酮含量的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[18]，準確吸取提取液1.00 mL，在堿性環境下，亞硝酸鈉-硝酸鋁為顯色劑，在510 nm波長處測定吸光度，計算樣品中黃酮的含量。

1.2.5.4 多酚含量的測定 采用酒石酸亞鐵法[19]，準確吸取提取液1.00 mL，注入比色管中，加蒸餾水和酒石酸亞鐵溶液，充分混勻后，再加入磷酸鹽緩沖液，在540 nm波長處，測定吸光度，計算樣品中多酚的含量。

1.2.5.5 多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸法[20]，準確吸取提取液1.00 mL，置于具塞試管中，加入苯酚和硫酸，顯色，在490 nm處測定吸光度，計算樣品中多糖的含量。

1.2.6 不同提取工藝提取液的制備

1.2.6.1 煎煮法 準確稱取稱樣品1.00 g，采用煎煮法[5]提取，在加入20 mL蒸餾水置于50 mL圓底燒瓶中，在60℃熱水浴中浸提90 min，然后過濾得濾液，再4000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.2.6.2 回流法 準確稱取樣品1.00 g，采用回流法[6]提取，置于50 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇溶液20 mL，在提取溫度為70 ℃下，提取100 min，再4000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.2.6.3 酶法 準確稱取樣品1.00 g，采用酶法[7]提取，置于50 mL三角瓶中，加蒸餾水20 mL，在50 ℃，pH為5.0條件下加1.5%纖維素酶，酶解50 min，再4000 r/min離心15 min，取上清備用。

1.2.6.4 超聲波法 準確稱取樣品1.00 g，采用超聲波法[8]提取，置于50 mL三角瓶中，加入20 mL體積分數為70%的乙醇溶液，在功率為100 W的超聲波清洗器中提取30 min，再4200 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.2.6.5 超聲波輔助酶法 準確稱取樣品1.00 g，采用超聲波輔助酶法[21]提取，置于50 mL三角瓶中，加入17 mL體積分數為70%乙醇溶液，功率為100 W的超聲波清洗器中提取32 min，加纖維素酶量2.6%，酶解時間49 min，溫度50 ℃，在4200 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.3 數據處理

單因素實驗結果重復三次，結果取平均值和標準偏差，響應面采用Design Expert程序設計軟件進行處理[22]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制備

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測得黃酮標準曲線，標準曲線線性回歸方程為y=0.0172x+0.0025（R2=0.9996）；采用酒石酸亞鐵法測得多酚標準曲線，標準曲線線性回歸方程為y=0.0208x-0.0036（R2=0.9993）；采用蒽酮-硫酸法測得多糖標準曲線，標準曲線線性回歸方程為y=0.0419x-0.0134（R2=0.9992）。以上標準曲線R2＜0.999，符合要求。

2.2 超聲波輔助酶法提取抗氧化物質單因素實驗結果

2.2.1 液料比對提取物羥基自由基清除率的影響由圖1可知，在超聲時間、加纖維素酶量和酶解時間保持不變，僅改變液料比時，羥基自由基清除率在60%～85%之間，當液料比為10:1～20:1 mL·g-1時，湖北海棠葉中抗氧化物的羥基自由基清除率逐漸增強，在液料比為20:1 mL·g-1時達到最大，液料比對羥基自由基清除率影響顯著（P＜0.05），且高于其他水平。繼續增加液料比，羥基自由基清除率逐漸降低。因為隨著液料比繼續升高湖北海棠葉中抗氧化物即使有少量溶出，但被溶劑大量稀釋[23]，羥基自由基清除率呈現緩慢下降。因此選擇最佳的液料比為20:1 mL·g-1左右。

圖1 液料比對羥基自由基清除率的影響Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on hydroxyl radical scavenging rate

2.2.2 超聲時間對提取物羥基自由基清除率的影響由圖2可知，在液料比、加纖維素酶量和酶解時間保持不變，僅改變超聲時間時，羥基自由基清除率在65%～90%之間，當超聲時間為10～30 min時，羥基自由基清除率逐漸增加，在30 min之后呈下降趨勢，在30min后達到最大，超聲時間對羥基自由基清除率影響顯著（P＜0.05），且高于其他水平。由于超聲波具有強力的機械切割作用，長時間的作用使得抗氧化物結構鍵能被破壞，從而使清除率降低[24]。因此最佳超聲時間為30 min左右。

圖2 超聲時間對羥基自由基清除的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on hydroxyl radical scavenging rate

2.2.3 加酶量對提取物羥基自由基清除率的影響由圖3可知，在液料比、超聲時間和酶解時間保持不變，僅改變纖維素酶添加量時，羥基自由基清除率在60%～85%之間，當纖維素酶的用量為1.0%～2.5%時，抗氧化物羥基自由基的清除能力逐漸增強，在2.5%時達到最高，加酶量對羥基自由基清除率影響顯著（P＜0.05），且高于其他水平。加酶量超過2.5%時，羥基自由基清除率不再增強。因為隨著酶量的增加，細胞壁與纖維素酶接觸增多，抗氧化物溶出加快，羥基自由基清除率增加。當加酶量超過2.5%后，底物與酶全部結合位點達到飽和狀態，繼續添加酶清除率不會提高反而造成浪費[16]。因此選擇最佳加酶量為2.5%左右。

圖3 加酶量對羥基自由基清除的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydroxyl radical scavenging rate

2.2.4 酶解時間對提取物羥基自由基清除率的影響由圖4可知，在液料比、超聲時間和纖維素酶添加量保持不變，僅改變酶解時間時，羥基自由基清除率在70%～85%之間，在酶解時間為10～50 min時，湖北海棠葉中抗氧化物羥基自由基的清除率逐漸增強，在酶解50 min后，羥基自由基清除率呈下降趨勢，在50 min達到最大值，酶解時間對羥基自由基清除率影響顯著（P＜0.05），且高于其他水平。因為酶解時間較短時，纖維素酶不能充分水解纖維素，從而使抗氧化性物質溶出較少。當酶解時間延長到50 min，纖維素酶與湖北海棠葉充分接觸，抗氧化物溶出最多，羥基自由基清除率達到最大，隨著酶解時間的延長，一部分抗氧化性物質可能被過度水解，生成不具有抗氧化活性的片段[25]，導致自由基清除率降低。即最佳酶解時間為50 min左右。

圖4 酶解時間對羥基自由基清除的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydroxyl radical scavenging rate

2.3 響應面優化結果分析

采用Design Expert軟件中的Box-Behnken程序進行分析，共設計29個實驗點。結果見表2。根據表2中的數據得到回歸方程為：Y=89.23-0.70A+0.78B+2.13C-0.51D+0.1AB-1.92AC-0.45AD-0.65BC-1.42BD+0.96CD-1.58A2-2.03B2-7.31C2-5.33D，對模型進行方差分析，結果見表3。

表2 響應面實驗結果Table 2 Data of response surface experiment

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可以看出，模型極顯著（P＜0.01），失擬項（P=0.1491＞0.05）不顯著，說明模型是合理的，模型決定系數R2為0.9614，說明該模型能較好的反映湖北海棠葉抗氧化物羥基自由基的清除率與液料比、超聲時間、加酶量和酶解時間的關系。其中加酶量（C）、液料比的二次項（A2）、超聲時間的二次項（B2）、加酶量的二次項（C2）、酶解時間的二次項（D2）、液料比與加酶量的交互項（AC）對應的響應值影響極顯著（P＜0.01）；超聲時間和酶解時間的交互項（BD）對應響應值影響顯著（P＜0.05）。各影響因素對響應值的影響性排序為加酶量（C）＞超聲時間（B）＞液料比（A）＞酶解時間（D）。

圖5分別顯示了6組以羥基自由基清除率為響應值的趨勢圖。等高線圖可直觀反映出各因素交互作用對羥基自由基清除率的影響，等高線越接近于橢圓，該因素對羥基自由基清除率影響越大，其中AC交互坡度最大，等高線趨于橢圓，BD次之，CD、BC、AD、AB均較圓，與回歸方差分析結果相符合，即交互作用AC＞BD＞CD＞BC＞AD＞AB。

圖5 響應面交互作用影響Fig.5 Response surface graph of interaction effect on hydrolysis rate

2.4 最佳工藝條件

利用Design Expert軟件對工藝條件進行優化，通過軟件分析得到湖北海棠葉抗氧化物羥基自由基清除率最佳提取條件為液料比16.82:1 mL·g-1，超聲時間31.71 min，加酶量為2.59%，酶解時間為49.18 min，預測羥基自由基清除率為89.60%。

2.5 響應面驗證分析

考慮到試驗的可操作性，利用最佳工藝條件做三次平行實驗，液料比為17:1 mL·g-1，超聲時間為32 min，加酶量為2.6%，酶解時間為49 min。為了證實預測值的準確性，在最優條件下進行驗證實驗，得到湖北海棠葉抗氧化物羥基自由基清除能力實際測量值為89.9%±0.06%，與預測值89.6%非常接近。試驗結果與戢得蓉等[26]的雪蓮果葉超聲波輔助酶法提取總黃酮率6.317%質量濃度為0.6 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率71.09%較接近；與柴軍紅等[27]的五葉地錦果實多糖、花色苷濃度在0.80 mg·mL-1時羥基自由基的清除率75.87%±1.61%、68.60%±1.52%結果略高。

2.6 不同提取工藝下活性成分含量及抗氧化性比較

不同提取工藝下活性成分及抗氧化性見表4。從表4中提取的黃酮和多酚含量看出超聲波法和超聲波輔助酶法與傳統提取法相比，抗氧化物活性成分含量提高了10%以上，而超聲波法和超聲波輔助酶法相差不大；從提取多糖含量來看超聲波法和酶法提取的含量分別比傳統煎煮法、回流法提高了5%左右，超聲波輔助酶法又比單一的超聲波法和酶法提取的多糖含量提高了5%左右，因為超聲波的機械切割作用能夠破壞細胞壁，而適當添加纖維素酶也能幫助抗氧化性活性成分溶出，使其含量增高，但是酶量過多時會破壞糖苷鍵，不利于多糖的提取[28]。

表4 活性成分及抗氧化性分析結果Table 4 Antioxidant content and clearance rate

從DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率的比較得出超聲波法比煎煮法、回流法和酶法提高了30%左右，而超聲波輔助酶法又比超聲波法提高了7%左右，能夠說明超聲波輔助酶法在活性物質提取上效果顯著。

綜上所述，傳統的煎煮法、回流法和酶法提取的抗氧化物含量較低，超聲波法和超聲波輔助酶法能一定程度上提高提取率，通過抗氧化物的清除率與標準VC對比也能得到超聲波輔助酶法提取的抗氧化物清除率最高，可見超聲波輔助酶法提取效果比傳統方法更優，在未來湖北海棠葉的抗氧化物提取上前景廣闊。

3 結論

本試驗在單因素實驗設計的基礎上，運用Box-Behnken響應面優化超聲波輔助酶法提取湖北海棠葉抗氧化物的工藝，對湖北海棠葉中抗氧化物的羥基自由基清除率的二次回歸模型進行設計分析，結果表明：模型擬合程度高，實驗誤差小。超聲波輔助酶法提取湖北海棠葉抗氧化物羥基自由基清除率的最佳提取工藝條件為：液料比為17:1 mL·g-1，超聲時間為32 min，加酶量為2.6%，酶解時間為49 min。在此工藝條件下，提取物活性物質的含量比煎煮法、回流法和酶法提高了12%左右，DPPH自由基清除率和羥基自由基的清除率與煎煮法，回流法和酶法提高了30%左右，與超聲波法相比提高了7%左右，說明此工藝是合適的，且此方法設備簡單，成本低，耗時少，為一些天然的植物原料的抗氧化提取物提供技術參考，為進一步開發和利用湖北海棠葉資源提供依據。