裂褶菌胞內多糖的提取純化及生物活性分析

李翹楚，張 璐，王紅艷，王增利，丁 強，王鴻磊,

（1.中國農業大學煙臺研究院，山東煙臺 264670；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

裂褶菌（Schizophyllum communeFr.）又名雞毛菌、白花、白參，屬于裂褶菌科、裂褶菌屬[1]，其質地柔嫩，味道鮮美，是一種非常珍貴的可食用真菌，具有滋補強身的作用[2]。

裂褶菌多糖（SPG）也稱裂褶菌素，是裂褶菌生物活性物質中最重要的成分之一，具有抗腫瘤性[3]、抗疲勞[4]、調節免疫功能[5-6]等功能，在食品、生物與醫藥等領域的應用前景十分廣泛。SPG來源于子實體、菌絲體或發酵液，分胞內多糖與胞外多糖[7-8]，具有獨特的β-（1,6）分支的β-（1,3）-D葡聚糖結構[9]，分子量從4萬到10萬不等。研究表明分子量和多糖的三維結構對其生物學活性具有重要影響。分子量大于100000的裂褶菌多糖活性較高，在水溶液中具備三股螺旋結構；而分子量小于50000的不具備三股螺旋結構的，沒有抗腫瘤活性[10]。國內對裂褶菌的研究起步較晚，且主要集中在裂褶菌營養生理和人工栽培上，裂褶菌多糖的研究與國外存在一起差距[11]。

食用菌多糖提取主要有熱水浸提法、堿浸提法、酶法、超聲波法、微波法等[12]，熱水浸提法使用最為廣泛，但存在耗時久、得率不高等問題[13]。超聲波法是利用超聲波的機械破碎和空化作用使細胞壁破裂，從而加速內容物向溶劑擴散的一種技術[14]。與傳統方法相比較，超聲提取法具有操作簡單、提取率高，對設備要求較低，提取耗時短等特點，在真菌多糖的工業生產中有較大應用潛力[15]。

本文通過超聲輔助熱水提取法從裂褶菌菌絲體中提取胞內多糖，并優化其提取工藝，對胞內多糖進行分離純化，并探究純化后多糖組分的體外抗氧化性和抑菌性，以期為裂褶菌多糖相關的保健品和食品的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂褶菌 由中國農業大學煙臺研究院食用菌實驗室選育、分離，于4 ℃保藏；AB-8大孔樹脂、DEAE-52離子交換基質 萊特新材料科技公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠、Tris-HCl、葡聚糖T-series標品、抗壞血酸 西格瑪上海貿易公司；水楊酸、鄰苯三酚博奧拓達科技公司；DPPH 源葉生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB） 杭州微生物試劑有限公司。

KQ-500DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CR21GⅢ高速離心機 Hitachi Koki公司；BS200S精密電子天平 德國Sartorius公司；Agilent 1206高效液相色譜儀 Agilent 科技設備公司；TU-1810PU紫外分光光度計 北京普析通用儀器廠；Paragon 1000PC紅外光譜儀 Perkin-Elmer股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂褶菌胞內多糖提取工藝優化

1.2.1.1 裂褶菌胞內多糖提取工藝 將裂褶菌接種到PDA平板上，25 ℃培養3～5 d。打取4個菌絲塊，接種到PDB培養基中，25 ℃、160 r/min培養5 d。發酵液6000 r/min離心10 min，收集沉淀。用蒸餾水洗滌三次，放置50 ℃烘箱中烘干至恒重，得裂褶菌菌絲體。將裂褶菌菌絲體粉碎，過40目篩。取適量裂褶菌粉末加入一定比例的水溶解，超聲處理，處理完畢后將其放置于90 ℃恒溫水浴鍋中浸提2 h。6000 r/min離心10 min，取上清液，利用AB-8大孔樹脂[16-17]除蛋白質和色素，減壓濃縮至原體積的1/3，4 ℃醇沉過夜[18]，冷凍干燥，得裂褶菌胞內多糖。計算裂褶菌胞內粗多糖得率。

多糖得率計算公式如下：

式中：Z—裂褶菌多糖的得率，%；Y—烘干所得裂褶菌多糖的質量，g；Y0—裂褶菌菌絲體粉末的質量，g。

1.2.1.2 單因素實驗 裂褶菌粉末10 g，超聲時間20 min，超聲功率180 W，設置水料比為15:1、20:1、25:1、30:1、35:1，考察料水比對胞內粗多糖得率的影響。

裂褶菌粉末10 g，水料比25:1，超聲功率180 W，設置超聲時間為15、20、25、30、35 min，考察超聲時間對胞內粗多糖得率的影響。

裂褶菌粉末10 g，水料比25:1，超聲時間30 min，設置超聲功率為60、120、180、240、300 W，考察超聲功率對胞內粗多糖得率的影響。

1.2.1.3 響應面法優化裂褶菌胞內多糖提取工藝根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理[19]和單因素實驗所產生的結果，采用Design Expert設計響應面優化因素水平表（見表1），實驗三因素分別用A、B、C表示，每個因素的三水平由低到高分別用-1、0、1表示。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.2 裂褶菌胞內多糖的分離純化

1.2.2.1 裂褶菌胞內多糖DEAE-52離子交換柱層析準確稱取樣品30.0 mg，溶于 8 mL 0.02 mol/L pH=7.4的Tris-HCl緩沖液中，用0.45 μm的濾膜過濾。之后上樣，先用 100 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫，依次用濃度0、0.3、0.6、0.9 mol/L NaCl的緩沖液洗脫，洗脫速度2 mL/min，4 mL/管收集。用苯酚-硫酸法[20]測定樣品中的糖含量，以洗脫管數為橫坐標，490 nm處吸光度值為縱坐標，繪制洗脫曲線，根據洗脫曲線收集洗脫峰，冷凍干燥后保存。

1.2.2.2 裂褶菌胞內多糖Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析 將10 mg經過離子交換柱層析的多糖樣品溶于4 mL去離子水中，用0.45 μm濾膜過濾后上樣，然后用200 mL去離子水洗脫，流速為1 mL/min，每管收集3 mL，用苯酚-硫酸法每管檢測，繪制洗脫曲線，收集洗脫峰，冷凍干燥后保存。

1.2.2.3 裂褶菌胞內多糖純度鑒定及分子量測定根據高效體積排阻色譜法（HPSEC-RID）[21]，對洗脫出的裂褶菌胞內多糖組分進行純度檢驗與分子量測定。檢測條件如下：高效液相色譜儀Agilent 1206；色譜柱：AgiLent GPC Columns PL MIXED-M（8 μm、300 mm×7.5 mm）；檢測器：示差折光檢測器；流動相：去離子水；工作參數：柱溫30 ℃、進樣量20 μL，流速1.0 mL/min。

用不同分子量的葡聚糖作為標準品，以保留時間為橫坐標，與其對應分子量的對數lg（Mw）為縱坐標，繪制標準曲線；追蹤裂褶菌胞內多糖在色譜柱中的保留時間，根據標準曲線計算其分子量。標準曲線為：lg（Mw）=-1.2577x+12.61（n=7，R2=0.9971）。

1.2.2.4 裂褶菌胞內多糖紫外光譜掃描 將分離純化并且干燥好的裂褶菌胞內多糖配制成1.0 mg/mL的溶液，以超純水為空白對照，在190～400 nm處進行紫外光譜全波長掃描，觀察掃描圖譜在260和280 nm是否出現吸收峰的情況[22]。

1.2.2.5 裂褶菌胞內多糖紅外光譜掃描 準確稱取分離純化后的裂褶菌胞內多糖樣品2.0 mg，加入100.0 mg烘干的KBr，在瑪瑙研缽中進行充分研磨，然后壓片，壓力為18 MPa，維持時間5～10 min，將壓片置于傅里葉紅外光譜儀中在4000～400 cm-1范圍內進行掃描[23]。

1.2.3 裂褶菌胞內多糖生物活性探究

1.2.3.1 裂褶菌胞內多糖抗氧化性測定 分別配制1、2、3、4、5 mg/mL的裂褶菌胞內多糖NSPG-1和抗壞血酸（VC）溶液，參照文獻[24-26]檢測裂褶菌胞內多糖NSPG-1對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率，計算IC50。

1.2.3.2 裂褶菌胞內多糖抑菌性測定 取OD值為0.4～0.6的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的稀釋液8 mL，添加0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的NSPG-1多糖溶液0.5 mL，以青霉素為對照，37 ℃培養12 h，測定抑菌性，計算IC50[27-28]。

1.3 數據處理

各項指標進行3次獨立重復試驗，實驗結果以平均值±標準差表示。采用Microsoft Excel 2016對數據進行處理，采用IBM SPSS Statistics 23對數據進行ANOVA方差分析，顯著水平設為P＜0.05；采用Origin 2018進行圖形的繪制，不同的字母表示各組間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 裂褶菌胞內多糖提取工藝優化

2.1.1 不同單因素對裂褶菌胞內多糖得率的影響由圖1A可知，隨著水料比的增加，胞內多糖的得率也隨之增加，當水料比為25:1時，多糖得率達到最高，繼續增加水料比胞內多糖得率逐漸降低。這是由于提高溶劑用量可增大體系擴散壓從而促進了多糖的溶出[29]。而料液比過高，可能會導致超聲波的振幅下降，降低空化效應，從而使多糖得率有所下降[30]。

圖1 不同因素對胞內多糖得率的影響結果Fig.1 Effects of three different kinds of factors on the yield of intracellular crude polysaccharides

由圖1B可知，隨著時間的增加，胞內多糖得率隨之增加，在超聲時間為30 min時，達到最高值，隨后緩慢下降。其原因可能是超聲波作用時間過長，空化作用力會使得多糖糖鏈受到破壞，導致得率下降[31]。

由圖1C可知，當超聲功率為60 W時，胞內多糖得率最低（11.87%）。當超聲功率在60～180 W時，得率增速最快，之后隨著超聲功率增加，胞內多糖得率增速放緩，當超聲功率達到300 W時，得率達到最高值。超聲波的空化作用會隨著超聲功率的提高而增強，適當提高提取功率可以提高多糖的溶出。但超聲功率過高，其高強度的空化作用可能會導致多糖結構破壞[32]，影響提取率，故選擇180～300 W作為超聲功率的優化范圍。

2.1.2 裂褶菌胞內多糖提取工藝的響應面優化 根據單因素試驗結果，以裂褶菌胞內多糖得率為響應值，以水料比（A）、超聲時間（B）和超聲功率（C）為自變量，進行三因素三水平的響應面優化試驗。試驗編碼表和實驗結果見表2。

表2 響應面試驗編碼表和實驗結果Table 2 Response surface test results

2.1.2.1 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert8.0對實驗結果進行方差分析、3D立體圖及相關系數的擬合以及模型回歸。通過響應面分析，建立以水料比A、超聲時間B、超聲功率C為三因素的數字回歸模型如下：

回歸系數及顯著性檢驗如表3所示，可以看出，該模型的P=0.0001，說明模型極為顯著；失擬項P=0.9283，說明無失擬因素存在，此模型的R2=0.9903，表明二次回歸模型選用是適當的。

表3 回歸系數及顯著性檢驗Table 3 Regression coefficient and significance test

分析模型中各個系數的P值，可知B、C、AC、BC、B2、C2對于裂褶菌胞內粗多糖得率的影響極顯著（P＜0.01），A、AB對裂褶菌胞內多糖得率影響顯著（P＜0.05），A2對于裂褶菌胞內粗多糖得率的影響不顯著（P＞0.05）。各個因素對胞內多糖得率影響程度的大小順序為：B＞C＞A。

2.1.2.2 交互作用響應面分析 圖2為水料比（A）和超聲時間（B）對于胞內多糖得率的影響。當超聲時間一定時，裂褶菌胞內多糖得率隨著水料比的增加而增加；當水料比一定時，裂褶菌胞內多糖得率隨著超聲時間的增加先增加后減??；響應面坡度陡峭，說明AB之間的交互作用明顯。

圖2 水料比和超聲時間的交互作用對裂褶菌胞內多糖得率的影響Fig.2 Interaction effect of water-to-material ratio and ultrasonic time on the yield of polysaccharides

圖3為水料比（A）和超聲功率（C）對于胞內多糖得率的影響。在一定超聲功率條件下，裂褶菌胞內多糖得率隨著水料比的增加而增加；在一定水料比條件下，裂褶菌胞內多糖得率隨著超聲功率的增加先增加后減?。籄C之間交互作用顯著；且裂褶菌胞內多糖得率隨著超聲功率的變化幅度明顯高于隨著水料比的變化幅度，說明超聲功率對實驗結果的影響比水料比更大。

圖4為超聲時間（B）和超聲功率（C）對于胞內多糖得率的影響。裂褶菌胞內多糖得率隨著超聲時間和超聲功率的增加呈現出先上升后下降的趨勢。響應面坡度十分陡峭且等高線圖呈現出橢圓形，說明二者交互作用十分顯著，這與方差分析的結果相符。

圖4 超聲時間和超聲功率的交互作用對裂褶菌胞內多糖得率的影響Fig.4 Interaction effect of ultrasound time and ultrasound power on the yield of polysaccharides

2.1.3 驗證實驗 通過Design Expert 8.0對于超聲輔助熱水提取裂褶菌胞內多糖的擬合分析，預測出最佳的工藝條件：水料比30:1、超聲時間30.26 min、超聲功率229.29 W，在此工藝條件下所得到的預測胞內多糖得率為18.01%；考慮到實際操作的情況，對工藝條件進行了些許修正，最終得到的最佳優化工藝為：水料比30:1、超聲時間30 min、超聲功率230 W；在此工藝條件下得到的實際胞內多糖得率為18.14%±0.33%。預測值與實際值的誤差為0.69%，說明通過響應面優化所得的裂褶菌胞內多糖提取工藝參數具有可行性。

2.2 裂褶菌胞內多糖的分離純化

2.2.1 裂褶菌胞內多糖離子交換柱層析 由圖5可知，實驗一共獲得4種裂褶菌胞內多糖組分，將含量最高的組分命名為NSPG-1并收集。

圖5 離子交換柱層析結果Fig.5 Ion exchange column chromatography results

2.2.2 裂褶菌胞內多糖凝膠柱層析 通過Sephadex G-100對裂褶菌胞內多糖NSPG-1的均一性進行初步鑒定，洗脫曲線如圖6所示，洗脫曲線呈現為單一的對稱峰，初步證明其為單一組分[33]，表明NSPG-1是分子量均一的多糖。

圖6 NSPG-1凝膠柱層析結果Fig.6 NSPG-1 gel column chromatography results

2.2.3 高效體積排阻色譜法純度鑒定及分子量測定裂褶菌多糖組分NSPG-1在HPLC上的洗脫曲線如圖7所示，胞內多糖NSPG-1經過高效體積排阻色譜法分離后得到的圖譜為單一對稱峰，說明組分純度較高且分子量是均一的[34]；其出峰時間為7.623 min，根據標準曲線方程計算可得：NSPG-1的分子量為1.05×106Da。

圖7 NSPG-1的HPLC洗脫曲線Fig.7 HPLC elution curve of NSPG-1

2.2.4 紫外光譜掃描純度鑒定結果 如圖8所示，NSPG-1在199 nm處含有多糖吸收峰，說明該物質確實是多糖；其在260和280 nm處均不含吸收峰，說明該組分不含蛋白質與核酸，表明裂褶菌胞內多糖得到了分離純化。

圖8 NSPG-1紫外掃描圖Fig.8 UV scan of NSPG-1

2.2.5 紅外光譜掃描結果 由圖9可知，NSPG-1在4000～400 cm-1范圍內都具有典型的多糖吸收峰：3400 cm-1處由羥基的變角振動與伸縮振動所引起的吸收峰，2930 cm-1附近由糖類C-H鍵伸縮振動所產生的吸收峰，1640 cm-1附近糖的水化物的典型吸收峰，1400～1200 cm-1附近由于C-H鍵的變角振動所引起的糖類特征吸收峰[35-37]。吡喃糖環會在1200～1000 cm-1處產生的強吸收峰[38]，而NSPG-1在1079 cm-1處有一個明顯的吸收峰，由此判定NSPG-1為吡喃糖；α型多糖在844 cm-1附近處有C-H鍵的特征吸收峰，β型多糖會在888 cm-1附近處產生CH鍵的特征吸收峰[39]，而NSPG-1在888 cm-1存在有一個吸收峰，而在844 cm-1附近沒有吸收峰，由此可知，NSPG-1為β型吡喃糖。本研究的紅外光譜與及多糖構型與某些裂褶菌子實體多糖[40]有很大差異，這可能是由于菌種、培養方式、純化組分不同等因素導致的。

圖9 NSPG-1紅外掃描結果Fig.9 NSPG-1 infrared scan result

2.3 裂褶菌多糖生物活性探究

2.3.1 NSPG-1體外抗氧化性測定 如圖10所示，NSPG-1對于DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，且在一定濃度范圍內，其清除自由基能力與多糖濃度呈正相關。其中NSPG-1對羥基自由基的清除能力最強，在質量濃度5 mg/mL時，清除率高達90.87%。NSPG-1對DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力稍差，清除率分別為43.12%和30.09%。NSPG-1對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為6.97、1.08和11.41 mg/mL。

圖10 NSPG-1體外抗氧化性結果Fig.10 In vitro antioxidant activity results of NSPG-1

2.3.2 NSPG-1抑菌性測定 如圖11所示，NSPG-1對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，且抑制率隨著多糖濃度的增大而增加。NSPG-1對三種菌的IC50值分別為7.56、12.54和10.42 mg/mL。

圖11 NSPG-1抑菌性結果Fig.11 NSPG-1 antibacterial results

3 結論和討論

本文以裂褶菌菌絲體為原料，利用響應面法對超聲輔助熱水胞內多糖工藝進行了優化，最佳工藝為水料比30:1、超聲時間30 min、超聲功率230 W；通過離子交換柱層析和凝膠柱層析成功分離出裂褶菌胞外多糖組分NSPG-1，此多糖為β型吡喃糖，分子量為1.05×106Da，并具有較好的抗氧化性和抑菌性。

裂褶菌是一種珍稀食用菌，然而較低的產量和高昂的價格，限制了其開發利用。多糖是裂褶菌主要的活性物質，本研究在工藝最適條件下，裂褶菌胞內粗多糖得率達到了18.14%，遠大于子實體多糖[41]得率，說明通過液體發酵產生菌絲體，利用菌絲體提取多糖是裂褶菌多糖開發利用的有效方式，此方式具有生產周期短、不受季節和地域的限制、成本低等優勢，適于裂褶菌工廠化開發利用。然而，不同的發酵條件對多糖產率影響較大[9]，故發酵條件優化也今后裂褶菌多糖研究的重要方向。裂褶菌胞內多糖NSPG-1組分具有較好的抗氧化性和抑菌性，可以應用于食品、化妝品等領域，具有一定的開發價值。本文僅對裂褶菌胞內多糖中含量最高組分的部分性質進行了研究，今后還需對NSPG-1多糖的單糖組分、抗腫瘤提高免疫性等生物學性質、化學改性等以及其他三種多糖開展進一步研究。