低溫等離子體對黃曲霉毒素B1的降解效能

李善瑞，趙璐玲，嚴文靜，章建浩

（南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產毒菌株產生的聚酮類次級代謝產物[1]，共有B1、B2、G1、G2、M1、M2等18種結構，以黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的毒性最強[2]。因低劑量即可導致肝臟致癌性，國際癌癥研究機構將AFB1列為Ⅰ類致癌物[3]。聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）評估全世界約25% 農產品因受霉菌毒素污染而報廢，其中黃曲霉毒素為主要污染物之一[4]。針對AFB1的嚴重危害性，如何安全有效地降低其污染水平成為了食品行業亟待解決的難題。AFB1結構穩定，在食品基質中一旦產生，便會持續存在[5]，268 ℃高溫下才可分解。目前，AFB1的降解技術根據作用原理可分為化學、生物和物理降解法，化學和生物降解法雖可有效地降低AFB1的含量，但是處理后AFB1降解產物安全性以及可能引發的食品安全問題為人們所擔憂，仍需進一步的毒理學、安全學以及營養學分析評估[6-7]；傳統物理降解技術有輻照、紫外光催化以及臭氧熏蒸法，輻照處理下AFB1降解率一般較低，采用20 kGy的輻照劑量處理花生粕，降解率僅為14.4%[8]，相同輻照劑量下處理AFB1含量為7.5 μg/kg的苦蕎飯，降解率為33.6%[9]，此外，輻照設備的成本較高，且長時間使用對于操作人員的健康存在威脅。紫外波長為362 nm的紫外光可以激發AFB1的活性從而促進其降解，但是由于穿透深度低、波長窄以及具有殘留毒性，紫外線降解AFB1的應用受到限制[10]；臭氧熏蒸法通常長時間處理才具有良好的降解效果，劉玉蘭等[11]采用臭氧熏蒸玉米胚80 min，AFB1降解率為72.27%，花生油中采用此法降解AFB1，40 min降解率為82.43%[12]。

相對于傳統物理降解技術造價高，耗時長，難以達到實際生產中快速降解AFB1含量的局限性，近年來，低溫等離子體作為一項新興技術，以其安全高效、非熱加工、無殘留[13]等優點受到了食品行業的廣泛關注。根據其放電類型可將其分為介質阻擋放電（Dielectric barrier discharge，DBD）、輝光放電、電暈放電和射流放電四種。低溫等離子體中含有大量高能活性粒子（H·、OH·、HO2·等）[14-15]，已被證實可用于真菌如黃曲霉菌[16]的滅活以及多種毒素如黃曲霉毒素[17]、嘔吐毒素[18]、以及T-2毒素[19]的降解。

目前報道的低溫等離子體設備峰值電壓較低且不可調頻，高峰值電壓可在短時間內產生更多的活性物質，可能會提高AFB1降解效能。此外，頻率作為影響低溫等離子設備活性物質產生速率的另一重要因素，不同研究中對于其與活性物質的生成速率的關系解釋不同 ，將頻率作為AFB1降解效能的影響因素并探究其與峰值電壓交互關系的研究尚未見報道。本研究采用DBD低溫等離子體設備，選取峰值電壓、工作頻率、作用時間作為單因素試驗條件，以AFB1降解率作為衡量指標，采用響應面研究各因素的交互作用機制，并探究此技術在黃曲霉毒素陽性檢出率較高的（3.5%～73%）[20]主要污染物玉米中的降解效果，從而為食品行業中的黃曲霉毒素污染提供新的解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米 市售；AFB1標準品（純度≥99%） 新加坡普瑞邦生物工程有限公司；甲醇 色譜級，乙腈色譜級，德國Merck公司；三氟乙酸 色譜級，上海麥克林生化科技有限公司；正已烷 色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高純氮氣（純度≥99.999%） 南京特種氣體廠。

介質阻擋放電低溫等離子體設備 南京農業大學聯合南京蘇曼等離子體工程研究院研發；PriboFast?226多功能凈化柱 新加坡普瑞邦生物工程有限公司；水浴氮吹儀 上海滬析實業有限公司；高速多功能粉碎機 武義海納電器有限公司；LC-20 AD高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC） 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 樣品包裝：6孔板中加入1000 μg/L的AFB1溶液，置于包裝盒（聚丙烯，145 mm×91 mm×22 mm）內密封包裝。

樣品處理：將包裝后的樣品放入DBD低溫等離子體設備上下兩極板之中，使其緊貼樣品包裝盒表面進行處理。

樣品衍生：參照《GB 5009.22-2016 食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[21]中高效液相色譜-柱前衍生法進行衍生后待測。

1.2.2 HPLC條件 參照劉真等[22]的條件并稍作修改，具體為色譜柱：InertSustain? C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相:乙腈:水（V:V=30:70）；流速：0.8 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃；運行時間：12 min，熒光檢測器：激發波長360 nm，發射波長440 nm。

1.2.3 標準曲線繪制 分別配制濃度為0、2.5、5、10、20、50、100、500、1000 μg/L的AFB1標準溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=138995.50x-1071189.75，R2=0.9984，具有良好的線性擬合關系，可用于定量分析。

1.2.4 單因素實驗 固定單因素條件：峰值電壓160 kV、工作頻率50 Hz、作用時間180 s，分別考察不同峰值電壓（60、80、100、120、140、160 kV）、工作頻率（50、80、110、140、170、200 Hz）、作用時間（30、60、90、120、150、180 s）對AFB1降解率的影響，并結合降解率確定最佳因素水平。

1.2.5 響應面試驗設計優化 采用Center Composite Design（CCD）試驗設計模型進行條件優化，響應曲面因素水平表如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factor level design of response surface test

1.2.6 玉米中AFB1降解效果研究

1.2.6.1 染毒玉米樣品制備及處理 玉米染毒：HPLC測得實驗所用原料玉米中AFB1為1.05 μg/kg，為獲得AFB1污染陽性樣本[23]，向50g玉米中加入0.5 mL AFB1甲醇溶液（1000 μg/L），混合均勻，于通風櫥內揮發近干。

染毒玉米樣品低溫等離子體處理：將50 g玉米置于包裝盒內，采用1.2.1同種處理方式進行低溫等離子體處理。

玉米中AFB1提取：玉米樣品經高速粉碎機粉碎后過0.85 mm孔徑篩，稱取5.00 g加入20 mL乙腈:水（V:V=86:14）高速攪拌2 min后，定性濾紙過濾，取8 mL濾液經PriboFast?226凈化柱純化，50 ℃水浴氮吹純化液近干，衍生條件同1.2.1，加入500 μL流動相復溶后待測。

1.2.6.2 低溫等離子體處理條件 選取1.2.5中優化后得出的最佳峰值電壓和工作頻率，考察不同作用時間（30、60、90、120、150、180 s）對玉米中AFB1降解率的影響。

1.3 數據處理

高效液相色譜平行三次測定AFB1含量。采用Origin 2022進行圖形繪制，IBM SPSS Statistics 2.0進行數理統計分析；P＜0.01表示差異極顯著。結合Design-Expert v 8.0.6中CCD模型進行響應面實驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 峰值電壓對AFB1降解率的影響 根據圖1可知，AFB1降解率隨著峰值電壓的增加極顯著升高（P＜0.01），與Siciliano等[24]的研究結果一致。峰值電壓為60 kV時，AFB1降解率為14.11%，HPLC法測得其含量為858.88±51.39 μg/L，當峰值電壓由80 kV增加至100 kV時，AFB1含量極顯著下降至96.65±9.77 μg/L（P＜0.01），此時，降解率為90.34%。降解率隨峰值電壓的升高而增加的原因可能是峰值電壓的提高導致介質阻擋放電兩電極極板間的電場強度增大，自由電子崩解速度和強度增加，電子轟擊和氣體解離及電離的能力增強，從而提高了活性基團（如OH·、H·）的形成速度，加速了AFB1的降解[14,25]。當峰值電壓提高至160 kV時，AFB1濃度降至15.97±1.73 μg/L，降解率達到最大值98.40%。綜上，峰值電壓最佳選擇范圍為120～160 kV。

圖1 不同峰值電壓對AFB1降解率的影響Fig.1 Effects of different peak voltages on the degradation rate of AFB1

2.1.2 工作頻率對AFB1降解率的影響 根據圖2可知，當頻率為50 Hz時，AFB1的降解率達到最大值94.52%，此時HPLC法測得其濃度為55.73±10.55 μg/L，與王玉[26]和王翠華[27]在研究頻率對微囊球藻毒素的降解效果中得到的50 Hz處理效果最佳的結論一致。隨著頻率在140～200 Hz范圍內的持續提高，AFB1的濃度分別為426.62±52.42、764.03±2.84、794.61±23.95 μg/L，均極顯著高于50 Hz處理組（P＜0.01），且降解率極顯著下降（P＜0.01），表明工作頻率的提高降低了AFB1的降解率，這可能與頻率的改變導致的活性物質生成速率有關，Yuji等[28]與汪超[29]發現頻率的提升可以促進脈沖放電等離子體射流中活性物質的產生，然而Wang等[30]發現頻率的降低可以增加低溫等離子體射流的放電強度從而促進活性物質的生成，可知等離子體激發方式不同對于活性物質生成速率影響不同，因此推測本研究中頻率的上升會導致DBD型低溫等離子體活性物質生成速率的下降，從而導致AFB1的降解率下降。綜上，工作頻率的選取范圍為50～110 Hz。

圖2 不同工作頻率對AFB1降解率的影響Fig.2 Effects of different working frequencies on the degradation rate of AFB1

2.1.3 作用時間對AFB1降解率的影響 根據圖3可知，低溫等離子體處理極顯著降低各處理組AFB1濃度（P＜0.01）。30 s作用時間下，AFB1降解率為87.45%，相較于紫外處理200 μg/L的AFB1溶液，33 min 50%左右的降解效果[31]，低溫等離子體可在短時間內快速降低AFB1含量[32-33]。60 s作用時間下，AFB1濃度下降為26.74±5.57 μg/L，120 s內濃度回升至68.80±0.73 μg/L，降解率相比60 s下降了4.35%。可見，AFB1殘留量并非隨著作用時間的延長而持續上升，Nishimwe等[34]與杜黎等[35]采用低溫等離子體降解AFB1時也出現濃度有所回升的現象。150～180 s作用時間內濃度下降至最低值6.14±0.17 μg/L，此時降解率為99.39%。綜上，作用時間選取范圍為120～180 s。

圖3 不同作用時間對AFB1降解率的影響Fig.3 Effects of different treatment times on the degradation rate of AFB1

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗設計方案及結果 響應面作為一種研究相關參數和獨立參數之間關系的有效統計方法，不僅可以減少試驗次數并且可根據單因素條件選定水平[36-37]，前期由單因素條件選定峰值電壓、工作頻率、作用時間的最佳取值范圍，根據CCD模型設計方案進行試驗，得到的試驗結果如表2所示。

表2 CCD設計方案及結果Table 2 Design scheme and result of CCD

2.2.2 模型方差分析 根據表3可知，模型中選取的A、B、C三因素與響應值Y之間均存在著顯著性關系，且模型本身顯著，失擬項不顯著（P=0.2542＞0.05），說明該模型構建合理[38]，同時R2=0.9781，R2adj=0.9500，說明模型擬合程度和相關性良好，變異系數（CV=3.79%）說明各變量間相對離散程度極小，同時，A、B、C影響均極顯著（P＜0.01），A與B交互作用極顯著（P＜0.01），A2與C2分別顯著（P＜0.05）。綜上，本模型能夠較好的應用于低溫等離子體對于AFB1降解效果的理論預測。根據F值可知，三因素對于AFB1降解率的影響次序分別為A（峰值電壓）＞B（工作頻率）＞C（作用時間）。

表3 低溫等離子體降解AFB1模型方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of AFB1 degradation model by cold plasma

2.2.3 回歸方程的構建與交互作用分析 經Design-Expert v 8.0.6 擬合出的多項式回歸方程為Y=-271.21699+3.29080A-1.76423B+2.12084C+9.19375×10-3AB-1.07292×10-3AC-1.69028×10-3BC-0.011711A2+2.56197×10-3B2-5.70469×10-3C2，因峰值電壓與工作頻率之間兩者交互作用極顯著（P＜0.01），為量化兩者交互作用關系變化對AFB1降解率的影響，對多項式回歸方程計算得到的結果如表4、表5所示。

表4 不同峰值電壓下工作頻率對AFB1降解率的影響Table 4 Effects of working frequency on the degradation rate of AFB1 at different peak voltages

表5 不同工作頻率下峰值電壓對AFB1降解率的影響Table 5 Effects of peak voltage on the degradation rate of AFB1 at different working frequencies

由圖4可知，峰值電壓與工作頻率之間的響應面交互作用圖傾斜程度明顯，結合方差分析結果可知兩者之間的交互作用對響應值影響極顯著（P＜0.01），當固定峰值電壓不變時，AFB1的降解率隨工作頻率的升高，曲面整體向下傾斜，表明工作頻率的升高會導致AFB1降解率的下降；固定工作頻率不變時，隨著峰值電壓的升高，曲面圖逐漸陡峭，表明峰值電壓的增高可以促進AFB1的降解。根據表4回歸方程分析結果可知，當作用時間趨近于0水平時，工作頻率對于AFB1降解率的影響值隨著峰值電壓的升高，其臨界值逐漸下降，兩者之間呈反比例關系（y=-1.78x+391.36，R2=1），峰值電壓在120～160 kV的范圍內升高，AFB1的降解率增加幅度明顯，與其單因素結果一致。由表5對工作頻率與峰值電壓的回歸方程分析結果可知，峰值電壓的臨界值隨工作頻率的增加而增加，兩者之間呈正比例關系（y=0.39x+133.63，R2=1），且工作頻率的增加會總體導致AFB1降解率的下降，但下降幅度較為平緩，與工作頻率中50～110 Hz范圍內，其降解率無顯著性的差異結果一致。

圖4 峰值電壓與工作頻率交互作用圖Fig.4 Interaction diagram of peak voltage and working frequency

2.2.4 CCD模型優化條件驗證 由CCD模型得到的峰值電壓、工作頻率、作用時間的最佳優化參數分別為157.16 kV、50.05 Hz、165.18 s，此時AFB1降解率的預測值為100%，為簡便實際操作，選定峰值電壓160 kV、工作頻率50 Hz、作用時間165 s，三次重復驗證實驗得出AFB1濃度為3.8±1.2 μg/L，降解率為99.62%±0.12%，與預測值結果相差0.38%，表明該模型擬合效果良好，具有實際參考意義。

2.3 低溫等離子體作用時間對玉米中AFB1降解效果的影響

根據2.2.4中CCD模型優化結果選取峰值電壓160 kV，工作頻率50 Hz作為固定條件，探究不同作用時間下低溫等離子體對于玉米中AFB1的降解效果，結果如圖5所示。

圖5 不同作用時間對玉米中AFB1降解效果的影響Fig.5 Effects of different treatment time on AFB1 degradation in corn

根據圖5可知，低溫等離子體處理濃度為23.35±0.79 μg/kg的玉米陽性樣品30 s時，AFB1降解率為7.25%。隨著處理時間的延長，玉米中AFB1降解率在180 s極顯著上升至39.29%（P＜0.01），優于常壓等離子體處理1.25 μg/kg玉米樣品10 min時65%的降解效果[39]。此時HPLC 法測得玉米中AFB1剩余含量為14.17±0.05 μg/kg，低于《GB 2761-2017 食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[40]對玉米中AFB1限量（20 μg/kg）。此外，目前報道的利用飛行時間質譜對低溫等離子體降解AFB1產物結構解析時，發現AFB1的主要致毒基團雙呋喃環結構消失，降解產物相較AFB1毒性降低[17,39,41]。同時，與溶液中AFB1的降解效果進行對比，發現其降解效率低于溶液中相同時間下90%以上的降解效果。玉米與溶液中降解效果不同可能是由于溶液中的AFB1在處理時可以充分暴露于低溫等離子體中，但玉米表面不平整，加標于玉米中的AFB1無法與低溫等離子體充分接觸所造成的[35]。

3 結論

本文研究了低溫等離子體激發條件（峰值電壓、工作頻率、作用時間）對溶液中AFB1的降解效果，并通過CCD模型優化工藝參數，在最優峰值電壓與工作頻率下，探究其在主要污染物玉米中的降解效果，結論如下：與對照組相比，溶液中AFB1降解率隨峰值電壓的升高、工作頻率的下降、作用時間的延長分別極顯著上升（P＜0.01）。響應面優化結果表明在峰值電壓為160 kV、工作頻率50 Hz、作用時間165 s的條件下，AFB1降解率達到最優值99.62%，此時HPLC測得濃度為3.8±1.2 μg/L。低溫等離子體處理玉米陽性樣品180 s時AFB1降解率為39.29%，表明低溫等離子體技術在玉米中對AFB1仍具有降解效果。綜上，低溫等離子體技術可在短時間內降低AFB1污染水平，工業化應用前景廣闊，但仍需深入大通量處理食品的低溫等離子體設備研發以滿足實際生產要求。