李俊杰,張幫磊,師 睿,李 浪,亢凱杰,葉 坪,彭 瀟,
(1.昭通學院化學化工學院,云南昭通 657000;2.云南省高校高原特色功能食品研究重點實驗室,云南昭通 657000;3.昭通學院,云南食品安全昭通研究院,云南昭通 657000)
昭通大豆醬(以下簡稱昭通醬)與傳統豆醬的區別在于其主料—黃豆是經過高溫炒熟制成,輔料主要有辣椒、花椒、香辛料和白酒等。昭通醬需經歷兩次發酵,第一次發酵主要是用炒熟的黃豆在自然條件下進行發酵,第二次發酵是在一次發酵的基礎上經過刷霉、粉碎、加料、曬醬等步驟制得,因工序繁雜,傳統上需加工半年才能制成[1]。昭通醬作為昭通當地傳統高原特色產品,其成品色澤鮮紅,口感協調,料液均勻,體態稀稠,具有豆醬固有香味及滋味[2]。由于昭通醬的制作過程與其它地區豆醬制作相似,是開放式“自然發酵”過程,其菌群復雜,如保藏不當容易污染雜菌[3-5]。
Han等[6]在豆制品加工過程中檢出金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等致病菌。羅信旭等[7]發現自然發酵的豆豉容易被蠟樣芽抱桿菌污染。白鳳嵐等[8]通過基因測序等技術從多份發酵食品中分離得到16株蠟樣芽抱桿菌攜帶毒力基因,而且這些毒力基因的存在可能會增加蠟樣芽抱桿菌的溶血風險。近年來由于豆醬保藏過程中造成中毒事件也越發頻繁,因此,對豆醬進行滅菌處理,為消費者提供安全食用保障很有必要。目前大多數豆醬由于其高鹽的特性很少進行滅菌處理,但豆醬作為豆制品,含有高蛋白和豐富的不飽和脂肪酸的特點[3],高溫強熱(蒸煮)會使得蛋白質過度變性,脂肪發生氧化,并且產生不愉快的高溫蒸煮味,使產品殺菌后風味品質下降,嚴重影響消費者的購買欲[9]。
輻照滅菌又叫做“冷殺菌”,是一種高效非熱加工技術[10],該技術有殺菌時間短,能耗低,不產生核廢料污染環境,以及無需高溫處理,最大限度保留了食品原有的風味品質等優點,近年來得到廣泛的關注[11-14]。世界衛生組織(WHO)、國際原子能機構(IAEA)和聯合國糧農組織(FAO)已經認可輻照技術應用于食品中的安全性[15-16]。輻照滅菌的原理是放射性同位素比如60Co和137Cs,所產生的γ射線或者利用電子加速器產生的超能電子束作用于樣品,使得樣品中微生物發生幾乎不可逆的物理、化學及生物學反應,而導致微生物失去活性甚至死亡的過程[17]。60Co和137Cs因其射線有穿透能力強和可靠性高的優點最先應用于食品加工行業,但也存在核安全問題以及利用率低的缺點[18];而電子加速器滅菌過程不需要輻射源,電子束的產生和消逝可控性強,能量利用率高且成本較低的優勢,正好彌補了放射性同位素輻照滅菌的不足,是一種理想輻照滅菌技術[19]。目前暫未發現采用電子束對豆醬進行滅菌的報道,因此本文基于電子束滅菌的優勢以及在前期的研究基礎上[1-2,20],采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質譜法(HS-SPME/GC-MS)探究了昭通醬電子束輻照過程中的揮發性物質的變化,以期為昭通醬的發展、創新以及更好地工業化生產提供參考。
昭通醬 實驗室自制,原料來自當地沃爾瑪超市(具體操作步驟參照作者前期工作[1]執行);重鉻酸銀和重鉻酸鉀銀劑量計 湖南省核農學與航天育種研究所提供。6890-MS 5973N型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;固相微萃取裝置及50/30 μm Carboxen/SPM萃取頭、色譜柱:HP-88石英毛細管柱(100 m×0.25 mm,0.20 μm) J&W Scientific, Incorporated公司(美國)。
1.2.1 昭通醬輻照處理 昭通醬選用避光紙質材料(內層為錫箔材料)進行密封包裝,分裝成每袋250 g。樣品準備完成后,立即進行輻照處理。
電子束輻照采用清華同方威視IS1020電子加速器在湖南湘華華大生物科技有限公司進行,功率15 kW,電子束能量10 MeV。將樣品平鋪于托盤上,對電子加速器功率進行設置,使其劑量率約1 kGy/s,樣品隨著環狀傳送帶進入輻照區,通過輻照區域即為一個周期或者一圈,通過調節傳送帶的速度控制輻照時間從而控制樣品所接收的輻照劑量。每一周期的平均輻照劑量約2.0 kGy,樣品每完成1個周期的輻照后即取出相應的樣品,并手動將其余樣品換面繼續輻照(輻照1個周期即2 kGy,輻照2個周期即4 kGy,以此類推)。輻照過程用重鉻酸鉀銀劑量計進行劑量跟蹤,重鉻酸鉀銀劑量計經中國計量科學研究院國家劑量保證服務(NDAS)比對標定,樣品分別于表面和底面的中心以及4個邊角處跟蹤劑量計,所有劑量計的平均值為平均劑量。劑量設計參考前期研究內容[20-21],分別為F-1 (0 kGy)、F-2 (2.00 kGy)、F-3(6.00 kGy)、F-4 (8.00 kGy)、F-5 (10.00 kGy)、F-6(12.00 kGy) ,電子束輻照實測劑量分別為F-1 (0 kGy)、F-2 (2.01 kGy)、F-3 (3.68 kGy)、F-4 (5.80 kGy)、F-5(8.15 kGy)、F-6 (9.80 kGy)。以上每個劑量設6個平行。樣品輻照后均貯藏于4 ℃冰箱中待檢測,所有樣品檢測重復3次。
1.2.2 感官評定方法 參考黃豆醬(釀造豆醬)的執行標準GB/T 24399-2009《食品安全國家標準 黃豆醬》稍作修改執行[22]:通過選取醬中主要揮發性物質種類和相對含量最多的時期對其色、香、味和體態進行感官評價,選取20名有經驗的感官品評人員,對色澤、香氣、口感、體態各占25分,滿分100分,具體評分標準及分值范圍見表1。

表1 昭通醬感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of Zhaotong soybean paste
1.2.3 微生物測定 菌落總數:參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》執行[23];霉菌:參照GB 4789.15-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》執行[24];大腸菌群:參照GB 4789.3-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》執行[25]。
1.2.4 揮發性成分的測定 參考蔣立文等[26]方法稍作修改,采用HS-SPME方法萃取樣品中揮發性化學物質,將灰色50/30 μm Carboxen /SPME 萃取頭在GC進樣口溫度為240 ℃的條件下老化1 h,備用;將不同劑量輻照后的昭通醬樣品進行研磨,分別取研磨后的醬樣約4 g于25 mL頂空進樣瓶中,用密封墊和蓋帽進行密封;然后在70 ℃條件下平衡30 min,將已活化的萃取頭穿過密封墊插入頂空進樣瓶內后推出纖維頭,露出纖維頭距離樣品液面約10~15 mm,頂空吸附40 min,插入GC進樣口解析5 min。
氣相色譜條件:HP-88石英毛細管柱(100 m×0.25 mm,0.20 μm);載氣:高純氦氣(99.999%),流速1.0 mL·min-1;進樣口溫度:250 ℃;不分流進樣。升溫程序:柱溫60 ℃,保持5 min,以3 ℃·min-1升至140 ℃,保持5 min,以5℃·min-1升至210 ℃,保持10 min,以5 ℃·min-1升至240 ℃,保持3 min。
質譜條件:離子源EI,溫度200 ℃;發射電流150 μA;倍增器電壓1037 V; 萃取頭接口溫度 220 ℃;電子能量70 eV; 質量掃描范圍45~500 amu。
定性分析:采用 NIST2014 s 標準質譜庫檢索,相似度在80%以上作為有效峰面積進行分析處理,根據保留時間確定不同發酵階段昭通醬樣品揮發性成分,用峰面積歸一化法進行相對含量分析。
采用Excel軟件、Origin2018、IBM SPSS statistics 26等軟件進行數據處理。
根據電子束輻照劑量不同,對樣品進行感官評分見表2,隨著輻照劑量的增加,感官評分逐漸降低,其中輻照劑量在9.80 kGy時昭通醬感官綜合總分最低,為60分,表明昭通醬在這個輻照劑量下品質不好,不容易被人接受;未輻照時昭通醬感官評分最高,為86分,當輻照劑量為3.68 kGy(F-3)時,昭通醬總體感官評分變化較小,超過該劑量時,醬體顏色開始變暗,并且有哈刺味產生,口感不協調,因此感官開始大幅度降低。輻照對色澤的影響較小,而對香氣、口感和體態影響較大,當輻照劑量為3.68 kGy時,昭通醬的香氣評分有所上升,隨后隨輻照劑量的增加而下降,可能因為低輻照劑量增加了香味物質的種類或者加強了香味物質的釋放,而高劑量處理后的昭通醬明顯有哈刺味產生,有可能由于輻照劑量的增加加速了油脂的氧化和酸敗造成的[27-28]。昭通醬主要原料為大豆,而大豆屬于高蛋白、油脂的食品,而且豆醬含水量一般較高,在電子束輻照過程中,食品中水會產生羥自由基,促進蛋白質和油脂發生氧化,導致食品產生哈刺味,或者輻照異味[29-31],也可能來源于蛋白質中含硫氨基酸氧化產生的硫化物[32]。根據前期研究數據[20],隨著輻照劑量的增加,昭通醬中過氧化值上升明顯,還原糖和蛋白質變化不顯著,當劑量超過3.68 kGy時脂肪下降顯著,因此綜合考慮可得知3.68 kGy內輻照的昭通醬基本能夠被人們所接受。

表2 不同輻照劑量對昭通醬感官評分的影響Table 2 Sensory evaluation of Zhaotong soybean paste at different fermentation stages
由表3可知,電子束輻照對昭通醬中菌落總數、真菌和大腸菌群負荷量的變化影響顯著,隨著輻照劑量的增加,樣品中菌落總數、真菌含量和大腸桿菌含量下降明顯,均呈顯著負相關(P<0.05)。當劑量為2.01 kGy時,大腸菌群數量已無法檢出;當輻照劑量3.68 kGy時真菌含量已低于最低檢出值;而劑量達到8.15 kGy時,菌落負荷量下降至最低檢出值以下,說明電子束輻照能有效抑制昭通醬中微生物的含量,延長貨架期。根據輻照劑量與菌落總數對數值的線性變化,可得出其回歸方程為y=-0.9263 x+6.5698(R2=0.9987),由此可計算出D10值為1.16 kGy,表明1.16 kGy的電子加速器輻照劑量可以使昭通醬中90%的細菌被殺死。當輻照劑量為3.68 kGy時,昭通醬中菌落總數為未輻照時的0.03%,同時真菌數和大腸菌群數已低于最低檢測限度。電子束輻照原理是電子通過真空管加速運動變成高能電子束照射在樣品上,使得某些物質發生一定的物理、化學和生物學效應[33]。昭通醬又屬于高水分食品,水受到高能輻射后會產生水化電子、羥自由基和氫原子自由基,這些物質都是高度活性進一步導致微生物衰亡,加強輻照滅菌的效果[34-35]。因此綜合感官評分結果,昭通醬的輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

表3 電子束輻照劑量對昭通醬微生物的影響Table 3 Effect of electron beam irradiation on microbial diversity of Zhaotong soybean paste
昭通醬經不同劑量電子束輻照處理后共鑒定出的揮發性化合物的種類及相對含量見表4。共檢出100種揮發性成分,主要由32種酯類、4種醛類、26種烯烴類、15種醇類、11種酮類、1種醚類、2種酚類和9種其它類物質組成。F-2樣品中揮發性物質種類最多有78種,隨著輻照劑量的增加,揮發性物質的種類有先增加后減少的趨勢。輻照前揮發性成分主要由異丁醇、芳樟醇、α-松油醇、4,7-二甲基十一烷、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯組成,其中,芳樟醇有鈴蘭花香,α-松油醇呈丁香香味。輻照后主要由芳樟醇、苯甲酸乙酯、棕櫚酸乙酯、石竹烯、茴香腦和川芎嗪組成,其中苯甲酸乙酯呈冬青油香氣,茴香腦呈甜味和具茴香的香氣,石竹烯有淡的丁香似香味,棕櫚酸乙酯帶有蠟香、果爵奶油香氣,這些物質豐富了輻照后昭通醬的風味。從圖1可知,左側柱狀圖代表各樣本揮發性成分種類數,上側柱狀圖以及下側的點線代表各組昭通醬之間揮發性物質的交集情況(即相同的揮發性物質種類數量),下側實心點的連線表示樣品與樣品之間共同揮發性物質的種類數,無連線表示該樣品獨有的揮發性成分種類數,如第一列結果顯示,昭通醬輻照組(F-2、F-3、F-4、F-5、F-6)與未輻照組(F-1)相比,經過輻照處理后仍保留有29種相同的揮發性組分,其中不同輻照劑量的樣品中揮發性成分種類交集數量較少,說明了昭通醬輻照后揮發性物質變化的無序性。但隨著劑量的增加,也有許多揮發性物質的相對含量均有所改變,結合表2感官評分結果,當輻照劑量超過5.80 kGy時,昭通醬整體感官發生了明顯的變化,結合F-2至F-6樣品中特有的揮發性成分,由表4可知,辛酸乙酯、17-甲基硬脂酸甲酯、正己酸乙酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、乙酸香葉酯、十四酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、癸酸乙酯、桃金娘烯醛、佛術烯、檜烯、月桂烯、γ-松油烯、十六烷、1-甲基-5-亞甲基-1,6-環癸二烯、十四烷、十二烷、桉樹醇、1-辛烯-3-醇、順式-7-十四烯-1-醇、胡椒酮、環十二酮(6Cl,7Cl,8Cl,9Cl)、β-酯羅酮、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪等物質基本構成了輻照后昭通特殊的氣味物質。

圖1 不同輻照劑量對昭通醬揮發性成分韋恩圖Fig.1 Venn diagram of volatile components in Zhaotong soybean paste under different irradiation doses

表4 昭通醬電子束輻照滅菌過程中揮發性成分組成及相對含量Table 4 Composition and content of volatile components in the process of electron beam irradiation sterilization of Zhaotong soybean paste

續表4

續表4
2.3.1 酯類組分變化 根據表4可知,昭通醬經輻照后酯類物質總含量有所上升。傳統發酵的昭通醬,酯類化合物能賦予其悅人的果香、甜香[36-37]。由表4可知,昭通醬主要的揮發性成分是酯類物質,其種類最豐富,有34種,未輻照的昭通醬中檢測出14種,通過輻照后酯類的種類增加了20種,在F-2 (2.01 kGy)時酯類總含量最大,達34.44%。亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、反油酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和棕櫚酸乙酯的相對含量隨輻照劑量的增加先增大后減少,苯甲酸乙酯的含量隨輻照劑量的增加而增大,從0.39%增大到5.16%,水楊酸乙酯和苯乙酸乙酯隨輻照劑量的增加而降低。其中辛酸乙酯、17-甲基硬脂酸甲酯、正己酸乙酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、乙酸香葉酯、十四酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、丙酸異戊酯、月桂酸甲酯、煙酸乙酯、油酸乙酯在未輻照前均未被檢出。據前人報道,酯類的增加說明樣品中形成該物質的底物(醇類和有機酸)有所增加,而這些底物的增加除了樣品本身所含有之外,還有可能來自蛋白質和脂肪的分解,特別是脂肪氧化后會產生系列的醇類物質和游離的脂肪酸[38]。
2.3.2 醛類組分變化 昭通醬經輻照后醛類物質總含量有所下降。由表4可知,傳統發酵的昭通醬,檢出了苯甲醛、(-)-桃金娘烯醛(香桃木醛)、2-異丙基苯甲醛,其相對含量相近分別為1.27%、0.66%、0.36%,桃金娘烯醛是經輻照后才被檢出,其相對含量在0.15%~0.17%之間。醛類物質輻照前總相對含量為2.29%,經輻照后變化較敏感,最終在0.45%~0.70%之間,此結果與呂梁玉等[39]研究輻照對帶魚魚糜醛類成分的影響結果基本一致。昭通醬產生醛類物質的途徑有很多,如酵母代謝產生飽和醛[40-41],Strecker反應降解產生醛[42]等,比如苯丙氨酸的降解產物就有苯甲醛[43]。出現此結果原因可能有兩點,參照前期研究結果[20]發現昭通醬在輻照過程中苯丙氨酸的含量變化并不顯著,其次輻照本身就有降解醛類物質的作用[44]。
2.3.3 烯烴類組分變化 根據表4可知,昭通醬經輻照后烯烴類物質總含量下降。昭通醬中被檢出的烯烴類化合物含量相對較少,但檢出的烯烴類化合物種類相對較多,有26種烯烴類。輻照前烯烴類物質只有7種且含量較低,分別為d-檸檬烯、羅勒烯(異構體混合物)、十五烷、石竹烯、香樹烯,4,11,11-三甲基-8-亞甲基-,(1R,4E,9R)-雙環十一碳-4-烯、4,7-二甲基十一烷,其中石竹烯含量隨著輻照劑量的增加上升明顯。經過輻照后產生了15種新的烯烴類,但總含量隨著輻照劑量的增加呈下降趨勢,說明輻照后隨烯烴類種類增多了,但相對含量卻呈降低趨勢。出現該結果主要原因有可能是脂肪酸烷基自由基的斷裂的結果[39]。
2.3.4 醇類組分變化 醇類化合物能賦予大豆醬宜人的特殊香氣。由表4可知,醇類物質總含量經輻照后變化不大。輻照前昭通醬中主要醇類物質有異丁醇、芳樟醇和α-松油醇,分別占36.90%、20.29%和4.56%,其中異丁醇經過輻照后其相對含量降低明顯,輻照不足1%,說明該物質對電子束輻照極其敏感,無論輻照劑量大小,下降幅度都很大,出現此結果的原因目前尚未清楚。芳樟醇輻照前相對含量為20.29%,經輻照后其相對含量增加至41.10%~60.60%。桉樹醇、1-辛烯-3-醇、順式-7-十四烯-1-醇、4-萜烯醇、香葉醇、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、(R)-α,α-4-三甲基-3-環己烯-1-甲醇,在輻照前未被檢出,輻照后有檢出,其中F-4檢出量較大。醇類物質種類增多大多數原因可能是由脂質氧化分解[39],也有可能是經輻照后使得某些以糖苷健結合的含羥基類物質釋放,以及氨基酸的去氨基和去羧基反應的原因[45]。
2.3.5 醚類組分變化 由表4可知,昭通醬中被檢出的醚類化合物含量和種類較少,只有一種鄰苯二甲醚,其未輻照前相對含量為0.30%,輻照劑量繼續加大,但鄰苯二甲醚的含量并未有明顯的變化。說明可能鄰苯二甲醚對輻照不敏感。
2.3.6 酮類和酚類組分變化 昭通醬中被檢出的酚類和酮類化合物種類和含量相對較少。其中,酚類物質共檢出2種。具有芳香氣味的愈創木酚在輻照前后均被檢出,輻照前相對含量為0.59%,但隨著輻照劑量的增加,愈創木酚的含量減少;2,4-二叔丁基苯酚只有經輻照后才被檢出且受輻照劑量的影響不大。酮類物質共檢出10種,其中(-)-α-側柏酮、茶香酮均被檢出,(-)-α-側柏酮在輻照前相對含量為1.37%,經輻照后該物質的含量大幅度減少,最低時只有0.13%,但在F-2 (2.01 kGy)至F-6 (9.80 kGy)的輻照劑量內對其含量影響不大。由表4可知,酮類物質的總含量在F-5 (8.15 kGy)時其相對含量達到1.51%,與未被輻照前含量一樣,但種類卻增加了8種,有可能脂類氧化促進了酮類物質的形成[39]。
2.3.7 其它組分變化 由表4可知,昭通醬經輻照后其它類揮發性物質總含量有所下降。在所有的樣品中均檢測出2,3,5-三甲基吡嗪、茴香腦、1,2,3-三甲氧基苯、川芎嗪,其中川芎嗪受輻照劑量影響最大,在未輻照前相對含量為0.50%,經輻照后含量有所增加,在F-4 (5.80 kGy)的劑量下輻照其相對含量達到最大值為12.52%。其它成分在輻照前未被檢出且含量相對較低。吡嗪類一般呈特色類似香料、香精的香味[46],隨著輻照劑量的增大,茴香腦和川芎嗪的含量上升明顯,茴香腦由輻照前0.49%最高上升至1.98%,川芎嗪由0.80%最高上升到10.60%。輻照前的昭通醬吡嗪類物質的相對含量為0.46%,經輻照后其相對含量為0.69%,總體變化不大。
食品中各類揮發性風味物質有著非常關鍵的聯系[47],Wang等[48]優化增味揮發性成分進行了提取,并對46種揮發性化合物進行了鑒定,結果表明大多數揮發性化合物的強度,特別是醛類和酯類,與增味感官呈正相關。輻照對昭通醬揮發性風味差異和組間樣本差異如圖2(左)所示,采用PCA多元變量統計分析,可知各組昭通醬的特征變量99.07%的累計差異被描述,包含86.11%的PCA1和12.96%的PCA2。可明顯看出輻照與非輻照的差異相當明顯,5個輻照組之間的差異較小,說明輻照對昭通醬中揮發性成分的影響比較明顯。各揮發性物質種類的相關性聚類情況如圖2(右)所示,烯烴類與醚類呈極顯著(P<0.01)負相關,醇類與酯類呈極顯著(P<0.01)負相關性,另外其它類物質與烯烴類(P<0.01)、醛類(P<0.05)呈負相關性,而與酯類呈正相關性(P<0.05)。此結果與表4中各揮發性物質的變化基本相符。

圖2 各指標間PCA分析及相關性聚類圖Fig.2 PCA analysis and correlation cluster diagram among indicators
隨著電子束輻照劑量的增加,昭通醬中微生物載荷量呈顯著下降趨勢,當劑量為3.68 kGy時,細菌、真菌數和大腸菌群數已達到衛生標準。繼續增大劑量,昭通醬的色澤、香味和口感均發生了不同程度的變化,甚至還會產生不愉快的氣味和滋味,表明3.68 kGy電子束輻照劑量既能殺死昭通醬中大多數微生物,又能使得產品風味變化降到最小。昭通醬經輻照后揮發性成分種類顯著增加,主要由酯類、烯烴類和醇類組成,其中酯類物質種類最豐富。研究結果發現輻照劑量對昭通醬中醇類、酯類及其它類揮發性物質影響較大,輻照促進了酯類揮發性物質的增多,但同時也增加了吡嗪類等特殊氣味物質的含量。
豆醬在我國歷史悠久,市面上不同豆醬都具有地方特色,但很多地方特色豆醬由于保藏期難以控制其品質,限制了銷售范圍。該研究分析表明輻照是昭通醬的可靠滅菌方法,雖通過PCA結果分析可知經過輻照后的昭通醬與未輻照的昭通醬無論感官、微生物含量以及揮發性成分之間均表現出一定得差異性,但只要控制好劑量,可以最大限度保留昭通醬原有的感官和風味,甚至低劑量輻照還能豐富昭通醬的風味成分。從研究結果中可看出輻照雖能解決昭通醬滅菌的目的,對改進地方豆醬規模化生產以及推廣當地高原特色農產品具有重要意義,但輻照也會導致產品中新物質的增加,其安全性尚待評估。