HS-GC-IMS技術判定鴨鎖骨貨架期及風味物質分析

姚文生，茍紫慧，劉登勇 ，張明成，楊 晶，蔡瑩暄，吳慧穎

（1.渤海大學，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州 121013；2.渤海大學化學與材料工程學院，遼寧錦州 121013；3.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121013；4.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇南京 210095）

醬鹵肉制品因其獨特的風味、營養價值而深受年輕消費者喜愛，但其貨架期短，容易變質。超過貨架期的肉制品不僅微生物超標，物理化學性質發生變化，同時其風味感官特性也有所改變。因此，醬鹵肉制品的貨架期的預測不僅是注重健康的消費者關注的熱點問題，同時也是生產公司將其推向市場面臨的一個挑戰。

目前常用的肉類新鮮度的檢測方法有揮發性鹽基氮（TVB-N）[1]、菌落總數[2]、近紅外光譜法[3]、電子鼻[4]和電化學傳感器[5]等。由于這些方法需要復雜的樣品前處理過程，使得操作變得較為繁瑣。頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）[6-8]是一種新興的技術，可用于測定食品中關鍵香氣成分的含量[9-10]，分析肉制品風味化合物變化進而判斷肉制品的貨架期。與傳統的方法相比，HS-GC-IMS具有響應速度快，靈敏度高，操作簡單等優點[11]；已廣泛應用于醫療檢測領域[12]、環境監測領域[13]、食品領域，如食品新鮮度評價、食品風味鑒別和食品摻假鑒別等方面[14-15]。Cavanna等[16]使用SPME-GC-IMS選擇并鑒定了不同批次雞蛋的揮發性物質，成功地對新鮮雞蛋樣品和非新鮮雞蛋樣品進行了區分。這些結果表明，GCIMS可用于建立不同貨架期的食品風味指紋圖譜，PCA是一種多元統計分析方法，可以結合HS-GCIMS對肉制品中揮發性風味物質進行檢測。

本研究以鴨鎖骨為實驗研究對象，首先通過pH、菌落總數等理化與微生物指標確定其貨架期；在此基礎上，通過GC-IMS技術鑒定其貯藏過程中揮發性風味成分變化規律，建立貨架期指紋圖譜，為生產公司提供貨架期檢測新的技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬鹵鴨鎖骨 遼寧聞天香食品有限公司，室溫下儲存0、2、4、6、8 d，分別取三個平行樣進行實驗；氯化鈉 分析純，天津市大茂化學試劑廠；氯化鉀分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；鹽酸 分析純，錦州古城化學試劑有限公司；硼酸 分析純，天津永晟精細化工有限公司；氧化鎂 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮 分析純，國藥公司；PCA培養基青島科技工業園海博生物技術有限公司。

FE20 pH計、ME104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；LRH-150L生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；K9840凱氏定氮 山東海能科學儀器有限公司；Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯用儀 G.A.S.Gesellschaft für analytische Sensorsysteme mbH公司；T25均質機 德國IKA集團；THZ-100B恒溫培養搖床、DHG-9240A電熱恒溫干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；LDZM-69L-II立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化性質測定 pH的測定：按照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》的方法進行測定。

揮發性鹽基氮（TVB-N）的測定：依據GB 5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的半自動凱氏定氮法。

水分含量的測定：按照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法并稍作修改，取樣質量為1.000 g左右，設置烘箱溫度為105 ℃烘至恒重。

菌落總數的測定：依據GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》并稍作修改，取樣10.000 g于滅菌的90 mL生理鹽水中，搖床振搖1 h。其余與國家標準一致。

1.2.2 揮發性風味物質的測定

1.2.2.1 樣品制備 取儲藏0、2、4、6、8 d的鴨鎖骨可食用部位于絞肉機中攪碎，稱取2.0 g樣品于20 mL頂空瓶中，每個樣品三個平行。

1.2.2.2 HS-GC-IMS測定條件 2.0 g樣品直接加入20 mL頂空瓶中，孵育溫度為60 ℃，孵育時間20 min，色譜分離采用FS-SE-54-CB-1毛細管柱（15 m×0.53 mm，1 μm膜厚），保持在60 ℃。氮氣作為載氣，從2 mL/min開始，持續2 min，然后在8 min增加到20 mL/min，在10 min增加到130 mL/min。

1.3 數據處理

使用儀器配套的分析軟件LAV（Laboratory Analytical Viewer，LAV）和GC-IMS Library Search軟件內置的2014 NIST數據庫對特征風味物質進行定性分析。運用LAV中Reporter和Gallery插件程序構建揮發性有機物的差異圖譜和指紋圖譜。采用Origin 2019b軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA），并生成PCA圖。

2 結果與分析

2.1 理化與微生物指標結果

為了評估鴨鎖骨產品貨架期，對常溫下不同儲藏時間的產品進行了理化指標的測定。主要有pH、TVB-N、菌落總數和水分含量，結果見圖1。

pH對于微生物的生長有重要影響，所以在肉制品新鮮度的檢測中pH是一項重要指標[17]。如圖1A所示，隨著儲藏時間的增加，pH呈現出下降的趨勢，這可能是因為在儲藏的過程中乳酸菌的生長導致的[18]。第6 d以后，pH出現了上升趨勢，推斷微生物分解蛋白質產生胺類物質導致pH上升[19]。

TVB-N是判定肉質腐敗的另一個重要依據，指肉制品中的蛋白質在內源酶或者微生物的作用下分解成氨、揮發性胺等堿性含氮物質，可用來衡量肉制品中蛋白質的降解程度[20]，判斷肉制品的新鮮度。根據國標GB 2707-2016《鮮（凍）畜、禽產品》和前人的研究成果[21-23]，肉及肉制品中TVB-N的標準：一級鮮肉≤15 mg/100 g；二級鮮肉≤20 mg/100 g。從圖1B中可以看出第6 d的含量為21.1±1.21 mg/100 g，已經不再新鮮不可食用。

水分含量與肉質的新鮮度也存在一定的關系，當水分含量高時，容易滋生微生物，造成微生物的繁殖進而影響變質程度[24]。從圖1C中也可以看出隨著儲存天數的增加，水分含量也呈現出上升的趨勢。

隨著儲藏時間的增加，細菌滋生繁殖從而加速了肉的變質，因此菌落總數可以作為評判肉制品微生物污染狀態的一個重要依據[25]。根據GB 2726-2016《食品安全國家標準 熟肉制品》中的規定，熟肉制品可接受水平的菌落總數限量值為1×104CFU/g，而最高安全限量值為1×105CFU/g[26]，即lg CFU/g為5。從圖1D中可以看出第6 d為5.82±0.08 lg CFU/g，已經超過國標規定。綜合四個理化指標判定鴨鎖骨的貨架期為不超過6 d。

圖1 室溫儲存過程中鴨鎖骨理化指標的變化Fig.1 Changes of physical and chemical indexes of duck clavicle during room temperature storage

2.2 風味物質的測定

2.2.1 不同儲藏時間下鴨鎖骨特征揮發性成分的差異分析 運用GC-IMS技術對不同儲藏時間鴨鎖骨樣本進行揮發性成分差異，圖2為二維差異圖。

采用HS-GC-IMS方法對不同貯藏時間鴨鎖骨樣品揮發性有機物進行分析，得到貨架期前后樣品中風味物質及其變化規律。為了更加明顯比較不同樣品的差異，選取其中第0 d樣品的譜圖作為參比，其他樣品的譜圖扣減參比，得到GC-IMS分析得出的風味物質差異圖2。結果顯示，不同儲藏天數的鴨鎖骨中風味物質的種類存在明顯差異，隨著儲藏天數增加，風味物質也逐漸增多。

圖2 不同儲藏時間鴨鎖骨中風味物質GC-IMS 2D差異圖Fig.2 GC-IMS 2D difference of flavor substances in clavicle of ducks with different storage time

為了更清晰地突出不同儲藏時間風味物質差異性，運用LAV分析軟件分析，得到不同儲藏天數下鴨鎖骨三維譜圖，見圖3?？v坐標為氣相色譜保留時間，橫坐標為離子遷移譜遷移時間。垂直線表示反應離子峰（reaction ion peak，RIP），紅色點代表反應離子峰。RIP峰兩側的每個點代表一種風味物質。白色表示濃度低，紅色表示濃度高，顏色越深，濃度越高?？梢郧宄乜闯霾煌A藏階段揮發性化合物的差異。與第0 d樣品相比，隨著貯藏時間的增加，產品中的風味物質明顯增加。總體而言，風味物質總量和含量明顯隨著貯藏時間的增加而增加。這可能是由于在貯藏過程中，尤其是貨架期前后食品腐敗變質會釋放出一些揮發性風味物質。

圖3 不同儲藏時間鴨鎖骨風味物質GC-IMS 3D圖Fig.3 GC-IMS 3D image of duck clavicle flavor substances at different storage times

2.2.2 特征性風味物質的定性 利用GC-IMS library Search 1.0.3軟件中的2014NIST數據庫和IMS數據庫對揮發性組分進行定性分析，如圖4。橫坐標代表遷移時間，縱坐標表示保留時間，用數字標記出的每一個點代表定性出的一種物質?？梢悦鞔_定性的揮發性物質有52種單體以及部分物質的二聚體，結果如表1，圖4中編號與表1中物質一一對應。

圖4 揮發性組分的定性結果Fig.4 Qualitative results of volatile components

由圖4和表1的定性分析可以發現，識別出的物質主要包括12種醛、13種醇、7種酮、8種酯、6種酸、2種吡嗪、2種呋喃、1種胺和1種碳氫化合物共52種化合物（表1）。醛類物質有丙醛、異丁醛、異戊醛、庚醛、戊醛、丁醛和苯甲醛等。醛類物質具有較低的香氣閾值，這些物質是影響鴨鎖骨風味的主要因素[27]。庚醛可能由油酸氧化所得，與鴨鎖骨中令人愉快的肉香味有關[28]；異戊醛有酸敗變質的氣味[29]。醇類物質有乙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇等，醇類物質大多數是由不飽和脂肪降解產生的，還有一部分可能是通過醛類物質還原得到[30]。酮類物質有2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和2-庚酮等。奶香味的3-羥基-2-丁酮是美拉德反應的羰基化合物，可能來自于油酸氧化或者葡萄糖分解代謝[31]。酯類物質有乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯等。酯是由肌肉組織中脂肪氧化產生的醇和游離脂肪酸的相互作用形成的[32]。吡嗪是肉制品中最重要的香味呈味物質，具有肉香味和烤香味[33]，來自于還原糖和氨基酸之間的美拉德反應。

表1 室溫條件下不同儲藏時間鴨鎖骨特征風味物質定性分析Table 1 Qualitative analysis of characteristic flavor substances of clavicle of duck under different storage time at room temperature

對室溫條件下不同儲藏時間鴨鎖骨特征風味物質進行了定量分析，結果如表2所示。在貯藏初期（0、2 d），2-甲基丁酸、庚醛、丁酸乙酯等物質含量明顯高于后期；在超出貨架期（6 d）時，可以看到2,3-丁二酮、丙酸、N-亞硝基甲基乙基胺等物質含量在6 d時顯著（P＜0.05）增加，說明鴨鎖骨的變質導致了這些物質的含量增加。

表2 室溫條件下不同儲藏時間鴨鎖骨特征風味物質定量分析Table 2 Characteristic flavor material quantitative analysis of duck clavicle under the condition of different storage time at room temperature

2.2.3 不同儲藏時間下鴨鎖骨特征揮發性物質指紋圖譜 為了更加全面對比不同儲藏時間揮發性化合物組分差異性，運用LAV軟件中Galleryplot插件對數據進行分析。得到鴨鎖骨指紋圖譜圖5。

圖5顯示了不同儲藏天數鴨鎖骨的指紋圖譜，每個實驗重復三次?？梢钥闯鲽嗘i骨在相同儲藏時間的揮發性物質濃度差異小，組內相似度高，而不同儲藏時間的揮發性物質濃度差異大，組間相似度低。其揮發性風味物質主要以醇、醛、酮、酯類化合物為主。該產品未添加防腐劑且在室溫下儲存，儲存初期（紅色框內）揮發性物質主要是異丁醛、戊醛*、庚醛、丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸丙酯、庚醛*、4-甲基-2-戊酮、乙醇、2-甲基丁酸、丙醛等物質，且隨著儲藏時間的增加含量逐漸減少；儲藏后期（粉色框內）正戊醇、乙酸異戊酯和異丁醇等風味物只有第6 d出現，（綠色框內）揮發性組分以酮、酸類化合物為主，如2,3-丁二酮、N-亞硝基甲基乙基胺、2,3-戊二酮、丁酸、丙酸等物質，這些物質的生成可能是因為氧化變質以及蛋白質分解。肉制品在加工儲存的過程中，氧化是導致變質的一個重要原因[34]。隨著儲藏時間的增多，這些物質的生成可以表示腐敗變質，可以作評估貨架期風味變化的特征標記物質。丙酸、N-亞硝基甲基乙基胺、順-3-己烯-1-醇、丙酮醇、異丁醇第6 d開始出現，根據理化指標結果判定這些物質的出現與變質有關。丁酸、2-甲基吡嗪、2,3-戊二酮前6 d含量較低，第8 d含量增多。GC-IMS技術得到的不同儲藏時間風味指紋圖譜，對評價鴨鎖骨的新鮮度有參考意義。

續表2

圖5 室溫條件下不同儲藏時間鴨鎖骨揮發性物質的指紋圖譜Fig.5 Fingerprints of volatile substances in clavicle of ducks at different storage times at room temperature

2.2.4 不同儲藏時間鴨鎖骨風味物質變化分析 為了更加直觀地分析不同儲藏時間的鴨鎖骨風味物質的變化，進行了PCA主成分分析，結果見圖6。由圖6A可以看出，主成分1和主成分2的貢獻率之和達到了77.2%，室溫儲藏條件下，貨架期0、2、4、6、8 d的鴨鎖骨樣品組內分別相對集中于一定的范圍，各組之間具有明顯的間距，能夠很好的區分不同的儲藏時間的樣品，結果表明儲藏時間相同的樣品重復性較好，儲藏時間不同的鴨鎖骨特征風味物質特異性較明顯。圖6A和圖6B結合可以看出0 d主要集中在第一象限，2和4 d集中在第四象限，6 d集中在第二象限，8 d集中在第三象限，超出貨架期后主要風味物質有乙酸異戊酯、異丁醇、丙酮醇、N-亞硝基甲基乙基胺、2-甲基吡嗪*等，與前述指紋圖譜所得結論一致。

圖6 不同儲藏時間鴨鎖骨PCA分析（A）和不同方差的載荷圖（B）Fig.6 PCA analysis (A) and loading maps with different variances (B) of duck clavicle at different storage time

3 結論

本文以醬鹵鴨鎖骨為研究對象，實驗探究了室溫條件下不同貯藏時間其pH、TVB-N、菌落總數和水分含量等指標的變化規律。貯藏時間達到第6 d時，結果顯示TVB-N含量和菌落總數都超過國家標準最高安全限量值，因此可以判定鴨鎖骨產品貨架期為不超過6 d。在此基礎上，采用HS-GC-IMS技術結合PCA分析方法對鴨鎖骨貯藏過程中的揮發性化合物進行了分析鑒定。GC-IMS技術共鑒定出52種揮發性風味物質，主要有醇類、醛類、酮類與酯類等物質。指紋圖譜與PCA結果顯示2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮*、N-亞硝基甲基乙基胺、2,3-戊二酮、丁酸、丙酸是鴨鎖骨超過貨架期后的主要特征揮發性風味物質，這些物質可以作為判定鴨鎖骨超過貨架期標記性物質。與傳統方法相比，GC-IMS技術具有檢測限低、常壓操作、無需樣品預處理和分析時間更短等很多優勢，基于該技術建立的鴨鎖骨貨架期指紋圖譜可以為生產公司提供新的技術參數。后續可以結合同位素標記等手段針對其貨架期前后風味物質形成機制進行探索研究。