玉米副產物發酵飲料對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠糖脂代謝的改善作用

王佳瑤，李 源，李一鳴，劉 嬌，許云賀，張莉力

（錦州醫科大學食品與健康學院，遼寧錦州 121001）

糖尿病是常見復雜的代謝疾病,其發病率正在以驚人的速度上升，可導致嚴重的健康和經濟問題[1]。目前，加強對血糖、脂質水平的控制以降低并發癥和疾病進展的風險成為現今一大難題[2-3]。而對于當前糖尿病的控制，臨床上較多使用西藥，主要是服用一些化學合成抗糖尿病藥物或人工注射胰島素治療[4-5]，市面上大多數降糖藥都或多或少存在一些可能危害患者健康的副作用[6]，如胃腸道不良反應，特別是惡心、嘔吐并導致患低血糖風險增加[7]。因此，發現和開發副作用少的替代藥物是目前的主要研究領域之一。

乳酸菌是能使糖發酵、并產生大量乳酸的一類有益菌，有合成和提高營養物質的生物利用度的能力，調節免疫系統，潛在降血糖能力以及減少乳糖不耐受癥狀等益處。有研究表明，補充乳酸菌可顯著提升糖尿病患者血清胰島素含量，并與糖化血紅蛋白改善作用有關[8-9]。高偉華[10]基于BSH（膽鹽水解酶）活性從胞內提取物篩選出2株具有調節Ⅱ型糖尿病小鼠血糖水平的干酪乳酸菌。Ejtahed等[11]證實乳酸菌發酵酸奶能夠改善Ⅱ型糖尿病患者的抗氧化狀態。

玉米須和玉米苞葉作為我國傳統“藥食同源”食材，具有廣泛的預防和保健的作用。玉米須不僅有利尿、利膽和止血等保健作用，還對糖尿病患者有一定的作用。玉米苞葉富含多種糖類物質和活性成分，可作為多種產品生產的原料[12]。有研究表明玉米須可以增進機體的胰腺的功能，推動胰島素分泌，提升耐糖量，降低血糖水平[13-14]。Lee等[15]證實玉米須黃酮類物質能夠降低血清膽固醇，預防肥胖。Pan等[16]通過實驗證明玉米須多糖（PCS2）能夠顯著降低鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病（T2DM）胰島素抵抗小鼠血脂及血糖水平。這些具有“藥食同源”作用的植物原料結合乳酸菌發酵可使活性成分含量提高從而增強其保健功能性[17]。經乳酸菌發酵產生的酶系作用，將植物基質中多酚等物質轉化為更具生物活性的形式或產生新的活性物質，使其功能性增強并豐富食物的營養品質[18-19]。

目前，市場上以玉米副產物為原材料結合乳酸菌發酵的產品較少，而且對于這些產品的功能性及體內活性是否表現良好還未知，無系統的功能性評價而難以被消費者接受。本課題組前期將玉米副產物結合乳酸菌發酵，研制出一款玉米副產物發酵飲料，通過非靶向代謝組技術測定飲料發酵過程中活性物質含量變化，結果表明經乳酸菌發酵產生多種具有調節糖脂代謝功能的活性物質[20]。因此本研究探討玉米副產物發酵飲料對糖尿病小鼠糖脂代謝的改善作用，為相關降糖降脂產品的功能性研究奠定基礎并提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級雄性KM小鼠 體重18±2 g，90只，生產許可證號為SCXK（遼）2014-0004，錦州醫科大學實驗動物中心；高脂飼料（主要成分：基礎飼料58.8%，豬油20%，膽固醇1%，膽鹽0.2%，糖20%）南京盛民科研動物養殖場；普通飼料（主要成分：蛋白質20%，水分10%，脂肪40%） 沈陽市于洪區前珉飼料有限公司；玉米須、玉米苞葉、桂花、梔子、苦蕎 錦州大潤發超市；乳酸乳球菌YM313（L. lactisYM313）、干酪乳桿菌YQ336[21]（L. caseiYQ336）錦州醫科大學食品微生物實驗室分離并保存；鹽酸二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） 美國Sigma公司；胰島素（insulin，INS）ELISA分析試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、游離脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

百捷血糖測試儀 勤立生物科技股份有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州恩培儀器有限公司；LD310-2電子秤 沈陽龍騰電子有限公司；RE-501旋轉蒸發儀 濟南海諾實驗儀器有限公司；SWCJ-1C超凈臺 蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS型滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；MSD550-3顯微鏡

邁時迪（東莞）科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米副產物發酵飲料的制備 剪碎→水提→過濾→調配→殺菌→接菌→發酵→冷藏參考張妍等[20]制作方法，按液料比3:1的比例添加主要原料玉米須和玉米苞葉（添加比例為玉米須：玉米苞葉=1:1），隨后添加輔料占總體積比例為0.5%桂花、0.2%梔子、5%苦蕎進行80 ℃ 1 h水提。使用20目篩子，8層紗布過濾，得到水提液。隨后添加7%的乳糖醇進行飲料的調配。將調配后的飲料進行95 ℃ 15 min殺菌。將殺菌好的飲料接種6%的乳酸乳球菌YM313和干酪乳桿菌YQ336（接種比例為1:1）。最后進行37 ℃ 15 h的發酵。即得發酵飲料，再經旋轉蒸發儀濃縮10倍，分裝至5 mL離心管，4 ℃冰箱保存[22]。

1.2.2 糖尿病小鼠模型建立與分組 實驗開始之前，所有雄性KM小鼠在24±3 ℃，55%±5%相對濕度，光照12 h或黑暗12 h/d，提供普通飼料和水，在此條件下，正常喂養一周使小鼠適應環境，開始正式實驗。適應性喂養后，取8只小鼠作為NC組，其余82只納入建模組，在模型建立期間，除NC組外其余小鼠均給予高脂飼料喂養。飼喂兩個月后，小鼠禁食12 h不禁水，連續3 d腹腔注射STZ注射液（40 mg/kg）后測定空腹血糖水平，建模成功標準為空腹血糖值≥11.1 mmol/L[23]。對建模成功小鼠進行隨機分組（每組8只），分成6組，在28 d實驗周期內除NC組外均飼喂高脂飼料，各劑量組每天灌胃發酵飲料1次，具體實驗分組及灌胃劑量見表1。所有動物實驗均在錦州醫科大學倫理委員會的倫理審查和監督下完成。

表1 動物實驗分組及實驗方式Table1 Group and method of animal experiment

1.2.3 日常生理指標的測定 觀察小鼠的日常活動和精神狀態，并于每7 d固定時間對小鼠進行稱重。

1.2.4 空腹血糖的測定 建模成功后將小鼠禁12 h后用血糖儀記錄各組小鼠初始空腹血糖值，實驗期間每7 d固定時間對小鼠進行空腹血糖測定一次。

1.2.5 口服糖耐量試驗 最后一次灌胃結束后，將小鼠禁食（12 h）后灌胃2 g/kg葡萄糖溶液。分別于0、30、60、120 min測定小鼠空腹血糖值，繪制血糖代謝曲線并計算血糖變化的曲線下面積（Area under the curve，AUC）。

1.2.6 血清生化指標 取小鼠眼眶血3500 r/min離心15 min，分離血清，按照說明書使用試劑盒測定血清中的血脂指標（TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA），抗氧化指標（SOD、MDA）和血清胰島素（INS）含量。

1.2.7 肝臟中指標檢測 取小鼠肝臟制備勻漿使用試劑盒測定肝臟中的谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）水平。

1.2.8 肝臟病理切片 用H&E染色法，對肝臟的組織病理學變化進行觀察。將肝組織于10%甲醛溶液（pH7.4）中固定。固定后，對肝臟組織脫水和包埋。將包埋的肝臟蠟塊切成薄片（4 μm厚），蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察（200×），拍取組織照片。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0進行數據處理，結果以平均值±標準差（±s）表示，用單因素方差分析（ANOVA）及事后多重比較進行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 CPFB對糖尿病小鼠體重的影響

如圖1所示，從初始體重來看，MC組小鼠的體重極顯著低于NC組小鼠（P＜0.01），表明糖尿病模型的建立可能導致小鼠出現典型癥狀“三多一少”癥狀。在實驗期間，MC組小鼠的體重變化總體呈下降趨勢，而NC組小鼠體重變化略有上升總體平穩，二者相比有極顯著差異（P＜0.01）。經過CPFB干預28 d后，MC組小鼠體重對比第0 d下降了10.26%，而H-CPFB、M-CPFB組、PC組及F-CPFB組的體重分別顯著下降了為5.71%、7.21%、3.64%、2.7%。表明經過CPFB干預可緩解小鼠體重的減輕，與MC組相比CPFB減緩了小鼠體重的下降速度，且效果優于PC組。楊紫滟[24]將玉米須黃酮應用于緩解STZ致糖尿病小鼠的體重降低情況，效果顯著。Guo等[25]研究結果表明四氧嘧啶誘導的高血糖小鼠給予玉米絲提取物后體重逐漸增加。

圖1 玉米副產物發酵飲料對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of CPFB on body mass of mice

2.2 CPFB對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

由圖2可知，從初始血糖值來看，MC組小鼠血糖水平極顯著高于NC組小鼠（P＜0.01），表明糖尿病模型建立成功。經過干預7 d后，各處理組血糖水平均表現不同程度的下降，與MC組相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。在實驗期間，MC組小鼠一直處于高血糖水平狀態，空腹血糖值一直保持在20 mmol/L以上。經過實驗28 d后，各組小鼠血糖值與第0 d相比均下降，H-CPFB、M-CPFB、L-CPFB組、PC組、F-CPFB組分別降低了32.59%、20.53%、7.51%、44.6%、38.73%，各組血糖水平極顯著低于MC組小鼠（P＜0.01）。其中PC組下降幅度最大，其次為FCPFB組和H-CPFB組。其中高濃度的CPFB及小鼠自由飲用飲料的降血糖效果最好，表明CPFB干預可減緩空腹血糖水平上升，達到較好的降血糖效果。這與藏傳剛等[26]研究玉米須多糖對糖尿病模型大鼠的降血糖作用研究結果一致。

圖2 玉米副產物發酵飲料對小鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effect of CPFB on fasting blood-glucose of mice

2.3 CPFB對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

如圖3a所示，MC組與各給藥組小鼠初始空腹血糖值明顯高于NC組，并且灌胃葡萄糖溶液后0.5、1、2 h的血糖值也明顯較正常組高。各組灌胃葡萄糖溶液后，血糖值隨時間呈現先升后降的趨勢。如圖3b所示，MC組較NC組的AUC值極顯著偏大（P＜0.01）；PC組與F-CPFB組AUC值極顯著小于MC組（P＜0.01），H-CPFB、M-CPFB、L-CPFB組的AUC值雖有下降趨勢不顯著。結果表明，糖尿病建模使小鼠出現了糖耐量損傷的情況，而自由飲用CPFB能夠改善口服糖耐量異常，且與使用鹽酸二甲雙胍治療的PC組效果相當。

圖3 口服糖耐量實驗中各組小鼠血糖值變化及血糖曲線下面積的變化情況Fig.3 Change of blood glucose in different groups during OGTT and the area under the curve (AUC)

2.4 CPFB對糖尿病小鼠血清生化指標的影響

糖尿病通常伴有高血脂癥，最明顯的表現為血脂指標升高，如表2所示MC組的TC、TG、LDLC、NEFA等血脂指標與NC組相比極顯著升高（P＜0.01），通過表中干預28 d后的小鼠血清生化指標的數據分析，各干預組小鼠的TC水平與MC組相比均有極顯著降低（P＜0.01），其中F-CPFB組效果最好，與NC組已無明顯差別。小鼠血清中TG水平除LCPFB組外其他各組均有顯著性降低，其中H-CPFB組與MC組相比降低了38.6%，LDL-C則只有HCPFB組和F-CPFB組有極顯著下降效果（P＜0.01）。對比NC組，MC組的NEFA數值提高了1.97倍，而H-CPFB、M-CPFB、PC組和F-CPFB組在降低小鼠血清中的NEFA方面具備更顯著的效果（P＜0.05或P＜0.01），分別降低了49.5%和40.5%、35.64%和25.69%。TC/HDL-C是反應冠心病的重要指標，常被用來表達脂代謝異常的結果。各組通過CPFB處理后TC/HDL-C的比值比MC組降低了37.46%、23%、4.9%、9.81%、35.18%。糖尿病引起的血糖水平升高致使葡萄糖自氧化，增加活性氧的生成，從而導致氧化應激[27]。MC組小鼠SOD活力水平極顯著低于NC組小鼠（P＜0.01），說明長期高血糖狀態導致了一定程度的氧化損傷。通過實驗28 d后，HCPFB、PC、F-CPFB組與MC組的SOD活力相比極顯著升高（P＜0.01）。MDA是氧化損傷的標志物，在實驗初期MC組的MDA含量顯著高于NC組，經過CPFB干預后H-CPFB、F-CPFB組MDA含量為7.95±0.64和6.84±0.45 nmol/mL，與MC組相比顯著降低了，表明經CPFB處理可以緩解T2DM導致的氧化損傷。綜上所述，高劑量的CPFB及小鼠自由飲用飲料表現出色的降低血清脂質水平和抗氧化作用，且效果優于鹽酸二甲雙胍治療，證明經過CPFB干預能夠調節糖尿病帶來的糖脂代謝紊亂和氧化應激。

表2 小鼠血清中血脂指標及抗氧化指標的變化（±s，n=8）Table 2 Changes of lipids and antioxidant indexes in serum of mice (±s, n=8)

表2 小鼠血清中血脂指標及抗氧化指標的變化（±s，n=8）Table 2 Changes of lipids and antioxidant indexes in serum of mice (±s, n=8)

注：與MC組相比，“*”表示差異顯著，P＜0.05；“**”表示差異極顯著P＜0.01；與NC組相比“#”表示差異顯著，P＜0.05；“##”表示差異極顯著P＜0.01；表3同。

組別 TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L） HDL-C（mmol/L） NEFA（mmol/L） SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）NC 5.98±0.68 1.162±0.04 0.75±0.33 3.90±0.87 1.45±0.67 84.80±3.32 5.77±0.44 MC 11.59±0.33## 3.53±0.131## 2.27±0.49## 4.87±0.19 4.32±1.23## 69.12±2.05## 9.1±0.38##PC 7.77±0.90##** 2.757±0.22##** 1.50±1.06 3.62±0.38 2.78±0.51##* 83.42±2.4** 8.06±0.58##H-CPFB 7.10±0.66#** 2.167±0.19##** 0.83±0.16** 4.77±0.46 2.18±0.77** 82.92±1.21** 7.95±0.64##**M-CPFB 6.78±0.42##** 2.414±0.27##** 1.79±0.49## 3.7±0.51 2.57±0.73#** 74.79±5.21## 8.93±0.63##L-CPFB 9.80±1.06##** 3.212±0.18## 1.72±0.73## 4.33±1.49 3.34±0.83## 69.9±4.1## 8.54±0.20##F-CPFB 6.00±1.13** 2.232±0.22##** 0.99±0.2** 3.89±1.3 3.21±0.87##* 80.74±2.87** 6.84±0.45##**

2.5 CPFB對糖尿病小鼠胰島素水平的影響

如表3所示，MC組胰島素水平為16.15±0.28 mIU/L較NC組10.21±0.94 mIU/L有明顯上升（P＜0.01），表現出胰島素分泌過多的問題，造成這一現象的原因可能是高血糖長期刺激產生大量的胰島素，降低了體內對胰島素的敏感性，最終導致胰島素抵抗。而其余幾組與MC組相比差異并不顯著。表中三種指標[28]代表胰島β細胞功能、胰島素抵抗指數（HOMA-IR）與胰島素敏感指數（ISI），其中MC組的HOMA-β極顯著低于NC組（P＜0.01），而HOMA-IR極顯著高于NC組（P＜0.01），這表明糖尿病小鼠的胰島β細胞功能受損并存在胰島素抵抗。H-CPFB組、M-CPFB組、L-CPFB組、PC組及F-CPFB組相比MC組，HOMA-β極顯著升高（P＜0.01）。H-CPFB組、M-CPFB組、L-CPFB組、PC組及F-CPFB組的HOMA-IR與MC組相比下降了31.33%、19.93%、16.14%、46.14%、33.19%。而對于ISI來說，各組沒有顯著差異。結果表明經CPFB干預后能夠有效改善模型小鼠的HOMA-β及HOMA-IR，緩解胰島素抵抗。李曉月等[29]研究結果表明玉米皮膳食纖維干預能夠降低胰島素抵抗指數，提高胰島β細胞功能，與本實驗結果基本一致。

表3 各組小鼠血清中胰島素水平及胰島素相關指標（±s，n=8）Table 3 Serum insulin levels and insulin-related indexes in different group (±s, n=8)

表3 各組小鼠血清中胰島素水平及胰島素相關指標（±s，n=8）Table 3 Serum insulin levels and insulin-related indexes in different group (±s, n=8)

組別 胰島素（mIU/ L） HOMA-β HOMA-IR ISI NC 10.26±0.75 67.58±4.97 2.98±0.22 0.016±0.001 MC 16.15±0.28## 15.81±0.63## 18.77±0.75## 0.002±0.001 PC 14.40±0.54## 23.42±0.88##**10.11±0.38##**0.004±0.001 H-CPFB 15.35±2.52## 19.28±2.35##**12.89±2.11##**0.003±0.002 M-CPFB 17.74±2.04## 22.80±2.62##**15.03±1.73##**0.003±0.003 L-CPFB 16.49±0.25## 18.33±0.28##**15.74±0.24##**0.003±0.001 F-CPFB 16.94±0.68## 23.12±0.40##**12.54±0.22##**0.004±0.003

2.6 CPFB對糖尿病小鼠肝臟中AST與ALT水平的影響

血清中AST和ALT體現了肝損傷的水平，從圖4能夠看出，由于糖尿病建模導致MC組小鼠ALT、AST水平極顯著高于NC組小鼠（P＜0.01），說明長期高血糖狀態導致模型小鼠出現肝損傷。其余幾組經過CPFB干預，相比MC組小鼠，H-CPFB、M-CPFB（P＜0.05）和F-CPFB組（P＜0.01）的AST水平均顯著下降，其中高劑量的CPFB效果最顯著，分別降低了21.89%、16.91%、13.24%。鹽酸二甲雙胍與CPFB處理則對ALT均無明顯效果。結果表明通過CPFB干預可以降低小鼠肝臟中的AST水平，進而緩解糖尿病導致的肝損傷。

圖4 各組小鼠肝臟中AST和ALT水平Fig.4 AST, ALT levels in serum of mice in different group

2.7 CPFB對糖尿病小鼠肝臟病理變化的影響

糖尿病會引起廣泛的肝臟疾病，從簡單的脂肪積累到最后導致非酒精性脂肪性肝炎[30]。從圖5得知，NC組肝臟組織細胞形態結構清晰，肝細胞索排列整齊，不存在脂肪性變的情況。MC組小鼠肝組織結構紊亂，細胞腫脹，細胞間隙變大，肝臟出現大小不一的脂肪液滴空泡。L-CPFB組與M-CPFB組小鼠肝臟仍存在不同程度的脂肪液滴空泡和組織結構紊亂，與MC組相比差異不大。F-CPFB組與PC組小鼠肝細胞脂肪性變基本消失，組織結構趨近于正常，且細胞形態與NC組相似。病理切片結果表明小鼠自由飲用CPFB能夠緩解長期高血糖帶來的脂肪性變及肝損傷，與鹽酸二甲雙胍治療效果相當。張眾一等[31]研究玉米須多糖確能減輕因糖尿病建模引起的肝損害，與本研究結果一致。

圖5 CPFB對各組小鼠肝臟細胞形態的影響（200×）Fig.5 Effects of CPFB on liver cell morphology in mice (200×)

3 討論與結論

糖尿病作為代謝性疾病其特征為糖脂代謝調節紊亂[32]。許多科學研究常使用糖尿病小鼠這種動物模型來作為糖尿病機制和藥物治療的研究對象。小鼠采用高脂飲食結合多次注射低劑量STZ誘導建模[33]，使模型鼠出現胰島素分泌功能障礙，血糖水平升高、體重減輕、肝臟脂肪變性和糖耐量損傷等癥狀[34]。本研究結果表明經過CPFB干預能夠顯著（P＜0.05或P＜0.01）降低模型小鼠空腹血糖水平，能夠減緩糖尿病引起的體重負增長。口服糖耐量實驗結果表明自由飲用CPFB能夠達到與抗糖尿病藥物相當的效果。未經過干預治療的糖尿病長期刺激產生大量的胰島素，使機體對胰島素不敏感，導致胰島素抵抗。而經過CPFB處理后，各組小鼠均能顯著（P＜0.05）降低HOMA-β和HOMA-IR，改善胰島素抵抗。

血清脂質異常是糖尿病的另一個特點[35]，長期被作為心血管疾病的首要風險源。高血糖可增加慢性炎癥標志物，促進活性氧的產生，最終導致血管功能障礙。丙二醛作為氧化應激生物標志物，在糖尿病模型小鼠的體內表達顯著升高[36-37]。之前也有研究表明玉米須多糖具有一定的降脂效果[38]，本實驗結果表明COFB能夠降低糖尿病小鼠血清中TC、TG、LDL-C、NEFA水平并改善SOD活力和MDA含量，與此研究結果一致。可能是由于CPFB中的玉米須經乳酸菌發酵提高了生物利用率從而達到良好的調節血脂效果和抗氧化作用。

肝損傷通常也為糖尿病的一大表征。胰島素抵抗導致肝糖異生增強和肝脂代謝受損，血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的含量增加[39]，從而導致肝脂肪變性和肝損傷[40]。既往研究表明，玉米須能夠改善糖尿病肝臟脂質積聚，防止肝組織形態學改變[41]。而本研究經過高劑量和自由飲用方式CPFB干預可使T2DM小鼠谷草轉氨酶水平顯著（P＜0.05或P＜0.01）下降，并通過肝臟病理切片觀察CPFB緩解了T2DM小鼠肝脂肪性變及肝損傷。

綜上所述，CPFB能顯著降低空腹血糖水平并調節糖脂代謝，緩解糖尿病引起的肝損傷及體重降低情況。玉米副產物作為廉價的植物源藥用食材，予以乳酸菌發酵提高生物活性，豐富了以天然抗糖尿病植物為原料輔助降糖飲料的種類，為糖尿病人可食用飲料市場提供了一個新產品和新思路。但具體降糖機制尚不明晰，相關研究還待進一步深入。