鱸魚抗氧化肽的穩定性分析及其對細胞氧化損傷的保護作用

高 群，黃淵楠，蔡茜茜，王一瀟，杜 明，劉永樂，汪少蕓,

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350108；2.大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034；3.長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南長沙 410114）

氧化應激是一種由反應物的產生和細胞自然抗氧化能力之間的失衡引起的正常細胞和分子功能的紊亂，通常由活性氧和活性氮自由基共同導致[1]。過多的自由基造成細胞內蛋白、脂質和DNA損傷，還會誘發細胞凋亡。隨著時間的推移，氧化應激可能導致一系列與衰老相關的退行性疾病，如癌癥、糖尿病、黃斑變性、阿爾茨海默病和帕金森病[2]。

食品源抗氧化肽因其安全性高、低成本、高活性、易吸收等優點備受研究人員的青睞，其中動物蛋白質來源的抗氧化肽往往具有很高的營養價值，利用動物蛋白制備抗氧化肽是近年來的研究熱門。Egerton等[3]水解藍鱈魚得到抗氧化活性肽并探究了其作為強化健康成分在飲料中的應用。吳明澤等[4]從中華圓田螺肉的酶解液中分離純化得到的多肽在小鼠體內具有良好的抗氧化活性。抗氧化肽活性的體外評價可以分為化學評價和細胞評價，常見的化學評價方法有測定自由基清除能力、還原能力、抑制脂質過氧化能力等[5]，而H2O2誘導的Caco-2和HepG2細胞損傷模型則是細胞評價的典型方法[6]。作為一種強氧化劑，H2O2能夠進入細胞形成活性氧自由基并引起脂質氧化、蛋白質氧化、細胞內膜系統損傷以及DNA損傷，甚至會造成細胞凋亡。目前，通過探究肽對細胞存活率、胞內ROS產量、抗氧化酶活等的影響，來自谷物、蛋類和魚類的多肽已被證明對H2O2誘導的細胞氧化損傷具有保護作用[7-9]。

鱸魚（Lateolabrax maculatus），又稱寨花、四肋魚，主要分布于太平洋西岸，在我國沿海地區均有生產[10]。鱸魚味道鮮美，又富含蛋白質、多不飽和脂肪酸和微量元素，綜合營養價值高，在民間食療方法中，常被用于產后或術后促進傷口愈合[11]。目前對鱸魚生物活性的研究涉及促傷口愈合作用[12]、降血脂作用[13]、抗菌作用[14]、抗氧化作用[15]、抗炎及免疫調節作用[16]。

目前對鱸魚抗氧化肽的研究多是只選用魚肉、魚皮或魚鱗作為原料，本研究使用僅去除內臟的鱸魚進行實驗，減少資源如魚骨的廢棄，為鱸魚的深度開發提供新的途徑。已有的研究缺少對肽的穩定性探究，未為肽在實際生產應用中的可能提供理論依據。本研究首先通過化學實驗對鱸魚蛋白水解物（Lateolabrax maculatusprotein hydrolysates，LPH）的抗氧化活性進行評價，并進一步考察其抗氧化活性的穩定性，最后利用H2O2模擬細胞內氧化應激狀態，探究LPH對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用，以期為LPH作為功能性食品成分應用于生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鱸魚 福建省福州市當地市場；Caco-2細胞系 北京北納創聯生物技術研究院；木瓜蛋白酶（800 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH） 東京化成工業株式會社；2,2” -聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）上海麥克林生化科技有限公司；H2O2西隴科學股份有限公司；活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） 上海碧云天生物技術有限公司；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測試盒、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒、總蛋白定量測試盒 南京建成生物工程研究所。

3111型CO2培養箱、Genesys 10s型紫外可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；Ts2-FL型倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；SpectraMax iD3型多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司； FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器公司；F-4600型熒光分光光度計 日本日立公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Super Mini Dancer型調速型迷你離心機 生工生物工程（上海）股份有限公司；TD5B型低速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；JY92-IID型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；MJ-BL25C3型絞肉機廣東美的精品電器制造有限公司；TH2-82型水浴恒溫搖床 金壇市鴻科儀器廠；FD-1C-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱸魚蛋白酶解物的制備 通過單因素和響應面試驗優化蛋白酶的種類、料液比、加酶量等條件，本論文探究前期最佳工藝條件下制備得到的多肽的抗氧化活性和穩定性。鱸魚去除內臟后用清水洗凈，將整條魚剁碎后用絞肉機攪成肉糜，在料液比1:3.8（g/mL）、加酶量2.14%（g/g）、酶解時間0.93 h條件下用木瓜蛋白酶進行對其酶解，酶解物凍干后于-20 ℃保存備用。

1.2.2 鱸魚抗氧化肽分子量的測定 采用高效液相色譜法測定鱸魚抗氧化肽的分子量分布，TSK gel 2000 SWXL（7.8 i.d.×300 mm）柱，流速為0.5 mL/min，上樣量為10 μL。

1.2.3 體外抗氧化能力實驗

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 根據顏阿娜等[17]的方法進行測定，配制0.1 mmol/L DPPH溶液（95%乙醇為溶劑），設置空白對照組（0.5 mL DPPH溶液與95%乙醇等量混合）、樣品組（0.5 mL不同濃度樣品與DPPH溶液等量混合）、樣品參比組（0.5 mL不同濃度樣品與95%乙醇等量混合），室溫下避光靜置30 min后于517 nm處測定吸光值并按下式計算：

式中：Ai：樣品組吸光值；Aj：樣品參比組吸光值；A0：空白對照組吸光值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定 根據Hernandez-Ledesma等[18]描述的方法并稍作修改，配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液，等量混合后于室溫下避光靜置16 h得到ABTS母液。配制5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4）作為稀釋和調零液，ABTS母液用PBS稀釋至在734 nm處吸光值為0.70±0.02，加入等體積樣品溶液（樣品組）或去離子水（空白組），混勻并靜置10 min，于734 nm處測定吸光值并按下式計算：

式中：A0：空白組吸光值；Ai：樣品組吸光值。

1.2.3.3 還原力的測定 參考張強等[19]的方法并稍作修改，配制0.2 mol/L PBS緩沖液（pH6.6）、1%K3[Fe（CN）6]溶液、10% C2HCl3O2溶液和1% FeCl3溶液。0.5 mL樣品（樣品組）或去離子水（空白組）與1.25 mL PBS、1.25 mL K3[Fe（CN）6]溶液混合，于50 ℃保溫20 min后加入1.25 mL C2HCl3O2溶液充分混勻，3000 r/min離心10 min，取1.25 mL上清液加入1.25 mL蒸餾水和0.25 mL FeCl3溶液，室溫靜置10 min后于700 nm處測定吸光值。樣品的還原力與吸光值成正比。

1.2.4 抗氧化活性穩定性實驗

1.2.4.1 pH穩定性 參考Singh等[20]的實驗，配制4 mg/mL LPH溶液，分別將其pH調至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，室溫（25 ℃）下靜置2 h后將pH調回原始pH，并測其DPPH自由基清除活性。

1.2.4.2 熱穩定性 參考Alahyaribeik等[21]的實驗，配制4 mg/mL LPH溶液，分別在25（室溫）、40、60、80、100 ℃下保溫2 h，每隔30 min取樣進行DPPH自由基清除活性的測定。

1.2.4.3 金屬離子穩定性 參考郭其洪等[22]的實驗并稍作修改，配制4 mg/mL LPH溶液，分別向溶液中加入KCl、CaCl2、CuSO4、ZnSO4，使金屬離子濃度分別達到0.25、0.5、1、2 mmol/L，室溫靜置2 h后測其DPPH自由基清除活性。

1.2.4.4 模擬胃腸道消化 根據劉珊珊等[23]的方法進行測定，配制4 mg/mL的LPH溶液，用0.1 mol/L HCl溶液調節pH至2.0后加入2%（g/g）的胃蛋白酶模擬胃消化，于37 ℃反應1 h，每0.5 h取樣用沸水煮10 min滅酶后進行DPPH自由基清除率測定；胃消化完成后用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0，加入4%（g/g）的胰蛋白酶模擬腸消化，于37 ℃反應3 h，每0.5 h取樣用沸水煮10 min滅酶后進行DPPH自由基清除率測定。

1.2.5 細胞內抗氧化實驗

1.2.5.1 細胞培養與分組 Caco-2細胞在含有20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液和1%非必需氨基酸的DMEM培養基中于37 ℃和5% CO2環境下培養。參考李亞會等[24]的方法并稍作修改，實驗分為H2O2模型組、LPH樣品組和空白組。模型組經650 μmol/L H2O2作用4 h后棄上清，加入新鮮培養基再培養24 h；樣品組在650 μmol/L H2O2作用4 h后棄上清，加入新鮮培養基和終濃度為100、200、400 μg/mL的LPH溶液，接著培養24 h；空白組的細胞正常培養，用PBS代替H2O2和LPH溶液。

1.2.5.2 細胞毒性實驗 調整細胞懸液濃度至5×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后加入80 μL/孔新鮮培養基和20 μL/孔不同濃度LPH溶液再培養24 h。采用MTT法[25]測定細胞毒性，培養完成后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養箱中孵育4 h后取出，去除上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下用96孔板震蕩儀振蕩10 min，酶標儀于570 nm處測定其吸光值。

1.2.5.3 MTT檢測H2O2誘導Caco-2細胞存活率調整細胞懸液濃度至3×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后根據實驗分組情況進行處理和培養后按照上述MTT法測定Caco-2細胞存活率。

1.2.5.4 細胞內ROS產量的檢測 調整細胞懸液濃度至1×105個/mL，每孔1 mL接種于12孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后根據實驗分組情況進行處理和培養。培養完成后，棄上清，用PBS洗2遍，每孔加入100 μL胰酶于培養箱中消化2 min后加入1 mL培養基吹打收集細胞，2000 r/min離心3 min去上清后再用PBS洗2遍，加入200 μL 10 μmol/L DCFH-DA 37 ℃避光反應30 min，2000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗2遍，用500 μL PBS重懸細胞，用熒光光譜儀檢測其熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm[26]。

1.2.5.5 熒光顯微鏡觀測細胞中線粒體膜電位的變化 使用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）對Caco-2細胞中的相對線粒體膜電位進行評估[8]。調整細胞懸液濃度至2×105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后根據實驗分組情況進行處理和培養。培養完成后棄上清，細胞與JC-1在37 ℃下避光孵育20 min。孵育結束后吸除上清，洗滌液洗2遍，每孔加入2 mL細胞培養液，熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.5.6 細胞培養上清中LDH水平的檢測 調整細胞懸液濃度至1×105個/mL，每孔1 mL接種于12孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后根據實驗分組情況進行處理和培養。培養結束后收集細胞培養上清，根據試劑盒說明書操作步驟進行LDH水平的檢測[27]。

1.2.5.7 細胞內SOD和CAT水平的檢測 調整細胞懸液濃度至2×105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后根據實驗分組情況進行處理和培養。培養結束后棄上清，PBS洗2遍，胰酶消化后再用PBS洗2遍，用500 μL PBS吹打收集細胞。用超聲波細胞粉碎機對細胞進行破碎后按照試劑盒說明書操作步驟進行SOD和CAT水平的檢測[28]。

1.3 數據處理

使用SPSS 26.0軟件對實驗數據進行統計分析，每次實驗做三個平行，結果用平均值±標準差表示，P＜0.05處的統計顯著性通過單因素方差分析（ANOVE）和Duncan多重比較確定。

2 結果與分析

2.1 LPH的分子量分布

采用高效液相色譜法測定LPH的分子量分布，由表1可知，LPH中分子量小于3000 Da的組分占91.12%，且小于1000 Da的肽段占比高達74.92%，說明LPH以短肽為主。

表1 LPH的分子量分布Table 1 Molecular mass distribution profile of LPH

2.2 LPH的體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除實驗常用來評價物質的體外抗氧化活性。如圖1所示，隨著LPH濃度的提高，DPPH自由基清除率也呈現上升趨勢，且在實驗濃度范圍內具有良好的線性關系。在4 mg/mL的樣品濃度下清除率達到81.41%，LPH對DPPH自由基清除的半數抑制濃度IC50值約為2.13 mg/mL，遠小于蔡金秀等[29]酶解馬面魚皮膠原得到的抗氧化肽的IC50值（13.03 mg/mL）以及張靖[30]使用堿性蛋白酶酶解羊骨得到的抗氧化肽的IC50值（23.45 mg/mL），這可能是因為與馬面魚皮膠原肽和羊骨肽相比，LPH中小分子肽（＜3000 Da）所占比例更多，研究表明小分子肽具有更強的抗氧化活性[26]。

圖1 LPH的DPPH自由基清除活性Fig.1 Free radical scavenging activities against DPPH of LPH

2.2.2 ABTS+自由基清除活性 ABTS+自由基清除實驗因其操作簡單、快速等優點被廣泛應用于物質體外抗氧化活性的檢測。如圖2所示，LPH對ABTS+自由基具有較強的清除活性在12.5～100 μg/mL濃度范圍內，ABTS+自由基清除率隨濃度的增大迅速升高，達到88.85%，而當濃度繼續增大到200 μg/mL時，自由基清除率為97.07%，得到LPH清除ABTS+自由基的IC50值約為31.53 μg/mL。與李軍[31]研究報道的鰱魚骨膠原多肽的IC50值（0.28 mg/mL）相比，LPH顯示出更強的ABTS+自由基清除活性。范德華力和疏水作用力可增強疏水性較強的大分子與自由基之間的作用力，可能是LPH與鰱魚骨膠原多肽中疏水性氨基酸種類及比例的差異導致了其ABTS+自由基清除活性的差異。

圖2 LPH的ABTS+自由基清除活性Fig.2 ABTS+ free radical scavenging activities of LPH

2.2.3 還原力 還原力指示物質在化學反應中提供電子的能力，還原力越強的樣品所表現出的抗氧化活性越強[32]。如圖3所示，在實驗濃度范圍內，還原力大小隨LPH濃度的增加而增加，這可能是由于LPH中存在電子密度較高的側鏈基團和相對較高的短鏈肽氧化還原電位，LPH作為還原劑，通過給出電子參與自由基的清除，從而達到抗氧化的目的[26]。

圖3 LPH的還原力Fig.3 Reducing power of LPH

2.3 LPH的抗氧化穩定性

2.3.1 pH穩定性 pH是影響活性肽穩定性的重要因素，食品加工過程中涉及的輔料、添加劑等物質可能會改變體系的pH，因此有必要對LPH的pH穩定性進行探究。如圖4所示，pH為6.0時，LPH的DPPH自由基清除率與未經酸堿處理的對照組無顯著性差異（P＞0.05）。經強酸或強堿處理后，LPH的DPPH自由基清除活性稍有下降，推測可能的原因是，極端的酸堿條件使多肽發生外消旋，部分LPH肽鏈構象的改變抑制了其與自由基結合的能力，最終造成了LPH抗氧化活性的降低[33]。堿性條件下的不穩定可能是半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸被破壞的結果[34]。但是，盡管LPH的DPPH自由基清除活性受到強酸強堿環境的影響，在pH2.0和pH12.0條件下，其清除率仍為對照組的94.44%和94.33%，說明pH對LPH的DPPH自由基清除活性影響較小，利于LPH在食品加工中的應用。

圖4 pH對LPH抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of pH on antioxidant activity of LPH

2.3.2 熱穩定性 溫度是影響抗氧化肽活性的另一重要因素，如圖5所示，隨著熱處理時間的延長，LPH的DPPH清除活性略有降低，但總體而言熱處理對LPH的DPPH自由基清除活性影響不大，即使在100 ℃的高溫處理2 h后，清除率也僅從84.99%下降至81.59%。與張靖[30]研究報道的羊骨抗氧化肽經100 ℃的高溫處理2 h后DPPH清除活性降至原來的42%相比，LPH具有良好的耐熱性，可能是因為LPH絕大部分是小分子肽，對溫度的敏感程度較低，與完整的蛋白質結構易受高溫影響變性從而導致活性降低不同，LPH中肽的結構變性較少，具有良好的抗氧化穩定性，利于其在食品熱處理工藝中的應用。

圖5 溫度對LPH抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of temperature on antioxidant activity of LPH

2.3.3 金屬離子穩定性 在食品加工過程中，原料、水以及添加劑中含有的K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Fe3+等金屬離子對人體所需金屬元素的補充至關重要，加之食品在加工、儲藏與運輸中不可避免要接觸金屬容器，金屬離子的存在可能影響產品的品質和功效，因此本實驗探究了金屬離子對LPH抗氧化活性的影響。如圖6所示，K+的加入對LPH的DPPH自由基清除率無顯著性影響（P＞0.05），而加入Ca2+和Cu2+后，隨著金屬離子濃度的增加，LPH的自由基清除活性也有所提升，在2 mmol/L Ca2+和Cu2+作用下，自由基清除率分別從85.30%升高至90.15%和88.38%。此外，低濃度Zn2+能夠提高LPH的自由基清除率，但當濃度繼續增大至1和2 mmol/L時，自由基清除率反而呈現下降趨勢，這結果與張翀[35]研究報道的當Zn2+濃度為5 mmol/L時，大黃魚抗氧化肽的DPPH自由基清除率顯著低于其他離子處理組類似，這可能是由于高濃度的Zn2+能影響肽分子上的氫原子和電子轉移，離子相互作用使肽的作用位點遭到屏蔽。因此LPH加工和保存過程中要盡量減少與富含Zn2+的材料接觸。

圖6 金屬離子對LPH抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on antioxidant activity of LPH

2.3.4 體外胃腸道消化對LPH抗氧化活性的影響口服抗氧化肽要發揮功效勢必受到消化酶的影響，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶等。在消化酶作用下肽類物質可能會發生結構上的改變，并對其生理活性產生影響。LPH的體外模擬胃腸道消化結果如圖7所示，在1 h的模擬胃液消化和3 h的模擬腸液消化過程中，肽的DPPH自由基清除活性較穩定，至消化結束時，自由基清除率與初始時無顯著性差異（P＞0.05）。與蔡金秀等[29]研究報道的馬面魚皮膠原抗氧化肽在經過胃液和腸液消化后抗氧化活性分別降低至初始值的89.99%和80.53%相比，LPH具有較好的胃腸道穩定性，這可能是因為LPH中的肽極少含有一些消化酶的潛在裂解位點，也可能是經消化后得到的小分子肽依然具有良好的抗氧化活性，而馬面魚皮膠原抗氧化肽中部分強活性的肽片段被水解成疏水性較低的游離氨基酸。

圖7 模擬胃腸道消化對LPH抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activity of LPH

2.4 LPH對H2O2誘導Caco-2細胞的抗氧化活性

體外化學實驗具有操作簡單、效率高等優點，但并不能真實反應LPH在生物體內的作用。因此，本研究采用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型對LPH的活性進行深入研究。

2.4.1 LPH對Caco-2的細胞毒性 如圖8所示，在12.5～400 μL/mL的LPH作用下，Caco-2細胞存活率均大于90.0%且與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），說明在該濃度范圍內，LPH對Caco-2細胞無毒性。

圖8 LPH對Caco-2細胞的細胞毒性Fig.8 Cytotoxicity of LPH in Caco-2 cells

2.4.2 MTT測LPH對H2O2誘導Caco-2細胞活力的影響 本實驗使用H2O2誘導的Caco-2細胞模型來探究LPH是否對Caco-2細胞的氧化損傷具有保護作用。如圖9所示，H2O2具有較強的細胞毒性，經650 μmol/L H2O2預處理4 h的陽性對照組細胞存活率顯著下降至58.02%（P＜0.05），而加入LPH能呈濃度依賴性地增加細胞存活率，在400 μg/mL時細胞存活率已恢復至83.40%，說明LPH能保護細胞免受氧化損傷，顯著提高細胞活力（P＜0.05）。這結果與彭新顏等[9]研究報道的中、高劑量組的藍點馬鮫魚皮抗氧化肽段能夠顯著提高Caco-2細胞的存活率類似，這可能是因為抗氧化肽能夠清除過量的自由基，修復損傷的氧化系統并通過抑制脂質過氧化和刺激抗氧化酶活性來保護Caco-2細胞免受H2O2誘導的氧化應激。選擇100、200、400 μg/mL的樣品濃度進行接下來的研究。

圖9 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞活力的影響Fig.9 Effect of LPH on the cell viabilty of H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.3 LPH對細胞內ROS產生的影響 作為能量代謝過程中產生的有毒副產物，活性氧的過量積累會對細胞造成損傷[36]。本實驗通過DCFH-DA熒光探針結合熒光分光光度計來檢測LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞釋放ROS的影響，結果如圖10所示，空白組中的正常細胞僅產生少量的ROS，經H2O2處理后，被氧化損傷的細胞產生大量ROS，H2O2模型組中ROS的熒光強度顯著增加（P＜0.05），而用LPH處理能夠呈濃度依賴性地降低ROS的產量，400 μg/mL樣品組的ROS產量已降至模型組的51.9%。這結果與Zhang等[26]研究報道的大豆蛋白酶解物能夠顯著降低由H2O2引起的胞內ROS堆積類似，這可能是由于攝入LPH后，抗氧化酶如SOD、CAT的表達得到提高，ROS被及時清除，同時細胞脂質過氧化得到抑制，從而有效防止了有害的ROS流入細胞。

圖10 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞內ROS產量的影響Fig.10 Effect of LPH on ROS generation in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.4 LPH對細胞線粒體膜電位的影響 線粒體是ROS的主要來源和靶點，也是氧化應激介導的膜蝕變的早期目標之一，包括通透性改變、膜電位喪失和促凋亡蛋白的釋放[37]。JC-1探針是一種親脂性陽離子染料，能夠選擇性地進入線粒體，隨著膜電位的降低，顏色從紅色變為綠色。如圖11所示，在空白對照組的正常細胞中，JC-1以聚合物的形式存在，呈現明亮的紅色熒光，而在陽性對照中，由于細胞被H2O2損傷，線粒體膜電位下降，JC-1為單體形式，出現大量呈現綠色熒光的細胞。但經過100、200 μg/mL LPH的處理，綠色熒光細胞的比例逐漸下降，在400 μg/mL時已恢復至正常細胞水平，在顯微鏡下幾乎看不見呈現綠色熒光的細胞，這可能是由于LPH可以通過減少胞內ROS堆積和脂質氧化來保護線粒體膜的完整性，緩解線粒體功能障礙[8]。

圖11 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞線粒體膜電位的影響Fig.11 Effects of LPH on mitochondrial membrane potential of H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.5 LPH對細胞培養上清中LDH水平的影響 細胞膜受損時，原本穩定存在于細胞質內的LDH會釋放到細胞培養液中，因此，可通過檢測細胞培養上清中的LDH活性來評估細胞受損程度。由圖12可知，H2O2使細胞嚴重受損，上清中LDH活力由空白組的14.19 U/L增加至109.46 U/L，而經不同濃度LPH處理后，LDH活力呈濃度依賴性顯著下降（P＜0.05），當LPH濃度增加至400 μg/mL時，LDH活力已與空白組無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于過量的自由基造成細胞膜脂質損傷，而LPH能夠抑制脂質的過氧化，修復受損的細胞膜并保護細胞膜的完整性，緩解了H2O2引起的細胞氧化損傷[9]。

圖12 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞上清中LDH水平的影響Fig.12 Effect of LPH on LDH activity in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.6 LPH對細胞內SOD活性的影響 以SOD為代表的抗氧化酶能夠中和在ATP生產過程產生的ROS，對酶系統具有保護作用，常用來測定細胞氧化損傷程度[38]。如圖13所示，H2O2具有強氧化性和滲透性，能夠直接破壞細胞內的大分子并造成細胞器的損傷，模型組中SOD活力相比空白組顯著下降（P＜0.05），而LPH能夠顯著增加SOD活力（P＜0.05），在100 μg/mL濃度下，細胞內SOD活力已經和空白組無顯著性差異（P＞0.05），而當肽的濃度達到200 μg/mL時，SOD活力甚至顯著高于空白組水平（P＜0.05）。這結果與張翀[35]研究報道的大黃魚蛋白源抗氧化肽可顯著抑制由H2O2引起的HepG2細跑內SOD活性的下降類似，表明LPH能夠修復細胞抗氧化防御系統，降低自氧化速率，緩解為了清除大量自由基而產生的酶促反應造成的抗氧化酶活性下降。

圖13 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞內SOD活性的影響Fig.13 Effect of LPH on SOD activity in H2O2-induced Caco-2 cells

2.4.7 LPH對細胞內CAT活性的影響 CAT催化H2O2分解成氧和水，從而保護細胞免受H2O2引起的氧化損傷[39]。如圖14所示，H2O2處理后過量的ROS造成內源抗氧化損傷，細胞內CAT活力顯著降低至空白組的71.85%（P＜0.05），但經LPH作用后，CAT活力呈濃度依賴性增加，當LPH的濃度達到400 μg/mL時，CAT活力可恢復至空白組的95.40%，和空白組無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于蛋白在細胞內主要以酶的形式存在，自由基直接攻擊酶蛋白使其肽鏈斷裂或導致側鏈氨基酸殘基的氧化和過氧化，蛋白功能性喪失使得CAT酶活力降低，而LPH通過清除自由基來保護CAT的活性[40]。

圖14 LPH對H2O2誘導的Caco-2細胞內CAT活性的影響Fig.14 Effect of LPH on CAT activity in H2O2-induced Caco-2 cells

3 結論

本實驗使用木瓜蛋白酶水解僅去除內臟的鱸魚制備抗氧化肽，體外抗氧化實驗測得LPH的DPPH、ABTS+自由基清除率的IC50分別為2.13 mg/mL和31.53 μg/mL，表現出較好的抗氧化活性。進一步對其抗氧化活性的穩定性研究發現，LPH具有良好的pH和熱穩定性。在0.25～2 mmol/L的濃度范圍內，K+對LPH的DPPH自由基清除率沒有明顯影響，Ca2+和Cu2+能夠增加自由基清除率，但是高濃度的Zn2+會降低LPH的DPPH自由基清除活性。在模擬胃腸道消化實驗中，LPH展現出良好的抗氧化穩定性。在細胞實驗中，LPH能夠增加被H2O2氧化損傷的Caco-2細胞的存活率，顯著減少ROS的產生（P＜0.05），細胞線粒體膜電位得到恢復，因細胞膜損傷而釋放到細胞培養上清中的LDH水平顯著降低（P＜0.05），抗氧化酶SOD和CAT的活力增強，證明了LPH在生物學功能上的抗氧化潛力，為其在食品保健領域的應用提供理論依據。