植物源性類黑精分離純化、結構分析及功能作用研究進展

趙藝飛，張仁堂, ，顏景焱，劉 靜

（1.山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018；2.山東土地鄉(xiāng)村振興集團有限公司，山東濟南 251000）

類黑精（Melanoidins）作為美拉德反應終產物，是還原糖和氨基酸經過一系列的縮合聚合反應生成的一種深色的復雜的大分子化合物[1-2]。由于受還原糖和氨基酸種類、溫度、處理時間、pH等因素的影響，它的結構和形成過程還不能被準確解釋[3-4]。同時，美拉德反應的發(fā)生一般會伴隨著其他非酶褐變的發(fā)生，如：焦糖化反應、抗壞血酸褐變、脂質褐變等[5-6]。美拉德反應是一系列還原糖與含氮化合物的級聯(lián)反應[7-8]，以上因素也會加劇反應產物的不確定性[9]。現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)的美拉德反應中間產物有：5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）、糠氨酸、雙乙酰、還原酮、3-脫氧葡萄糖酮、酮亞胺、醛亞胺等，這些中間產物可以進一步與氨基化合物聚合，最終生成大分子物質類黑精。美拉德反應發(fā)生在食品加工（如：高溫、油炸等）、運輸以及儲藏的各個環(huán)節(jié)中[10]，類黑精廣泛存在于人們那的日常飲食中（圖1），食品安全問題成為了研究的重點[11-13]。

圖1 植物來源類黑精相對含量[3]Fig.1 Relative content of melanoidins from plants[3]

本文植物源性類黑精是指植物生長過程中產生的類黑精或者植物經過高溫處理以后產生的類黑精。除了植物來源類黑精，還有動物來源類黑精——在動物的加工過程中產生的類黑精。相比較而言，植物源性類黑精具有簡單易得、樣本可重復性高、研究更廣泛的特點。近年來，對于植物源性類黑精的功能作用研究不斷深入，但是對于類黑精結構的研究還不充分。本文就植物源性類黑精展開（圖2），對類黑精的分離純化及結構分析進行綜述，以期為以后類黑精分離制備及深入研究提供參考；同時對現(xiàn)有的植物源性類黑精功能性質研究進行綜述，綜合分析類黑精的安全性。

圖2 植物源性類黑精研究方法Fig.2 Research methods of melanoidins from plants

1 類黑精分離純化

目前，對于植物源性類黑精的分離純化方法分為：大孔樹脂、超濾、凝膠層析和離子交換層析（表1）。類黑精是一系列復雜的級聯(lián)反應后期經過脫水、環(huán)化、重排、異構化、聚合等生成，所以結構還不能被人們準確的表征，這使得分離純化也復雜化，就目前方法而言，可以通過測定420 nm或470 nm處的吸光值大小來確定類黑精的相對含量，或者是通過測定類黑精中不同分子量的組成將其成分進行區(qū)分。

1.1 大孔樹脂

大孔樹脂是一種多孔骨架結構，根據(jù)極性可分為：非極性、中等極性和極性。在類黑精純化過程中一般使用弱極性樹脂吸附，不同類型大孔樹脂對不同來源植物源性類黑精吸附效果見表2。由表2可知，不同來源的植物源性類黑精具有不同的吸附特性，這可能是由于不同的美拉德反應底物以及反應條件的不同所導致。這也印證了美拉德反應的復雜性，以及處理方式對于植物源性類黑精的影響。但是，經過大孔樹脂處理后的類黑精溶液都表現(xiàn)出更高的抗氧化活性。

表2 大孔樹脂對植物源性類黑精的吸附特性影響Table 2 Effect of macroporous resin on the adsorption properties of melanoidins from plants

1.2 超濾技術

超濾是一種膜分離技術，成為研究類黑精的一個重要方法，在國內外廣泛應用。王月麗[18]依次使用不同分子量截留值的濾膜對黑蒜中類黑精進行分離得到四組不同分子量的類黑精溶液，四組的分子量分別為：高分子量（＞50 kDa），中等分子量（10～50 kDa；1～10 kDa），低分子量（＜1 kDa），然后通過凝膠滲透色譜對四組類黑精溶液進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，不同分子量的類黑精溶液具有不同的吸收峰，中、高分子量組分中會含有低分子量組分的吸收峰，同時，高分子量組分的雜峰更少，分子量分布更集中。鄭佳佳[17]將類黑精分別通過3、10、30、50 kDa的濾膜，得到相應的組分。Wang等[8]分別用3.5 kDa或25 kDa濾膜過濾，得到大于3.5 kDa或25 kDa的類黑精樣品。Wu等[19]將制備的黑蒜類黑精樣品溶液通過50 kDa和10 kDa的濾膜，得到三個不同組分的類黑精溶液。Zhao等[20]用12 kDa的濾膜截留黑蒜類黑精提取液，保留高分子量組分備用。綜上，美拉德反應是一個復雜的級聯(lián)反應，通過超濾能夠分析不同分子量的相對含量，有助于分析反應所處的階段，以更好地控制產品的品質。同時，它具有操作簡單，分離速度快、分離效果好等優(yōu)點，方便大規(guī)模制備樣品。但也應考慮到，超濾不能將樣品中的其他物質進行分離，只是將樣品按照濾膜孔徑進行分組。

1.3 層析技術

層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。在類黑精的分離中一般使用葡聚糖凝膠層析和離子交換層析或者同時使用兩種分離技術。鄭佳佳[17]聯(lián)合使用Sephadex G-50凝膠過濾層析和DEAE-Sepharose fast flow，發(fā)現(xiàn)最佳上樣濃度為50 mg/mL，不同的洗脫劑洗脫效果區(qū)別不大；同時，在最佳條件下，測定分離過程中多糖的含量變化，發(fā)現(xiàn)由于大分子量多糖與大分子量類黑精分子量相近不能實現(xiàn)完全分離。Xu等[21]使用DEAE-Sepharose fast flow和Superdex對分子量大于3.5 kDa的食醋類黑精進行分離，得到四個不同的組分，發(fā)現(xiàn)其多為美拉德反應初期產物，在290 nm具有較高吸收峰。綜上，葡聚糖凝膠層析和離子交換層析可以用于類黑精的分離，但是不能排除多糖、蛋白等大分子量物質的影響。

2 類黑精結構表征

類黑精因其復雜的結構，很難被人們研究。為了簡化研究，以及制備具有可重復性的類黑精，有研究采用特定的還原糖和氨基酸來制備模型類黑精，結果表明不同條件下生成的類黑精也是不一樣的[22-23]。同時，類黑精的具體結構及生成機理仍不能進行明確的表征和解釋。pH是美拉德反應過程中影響反應中間體和反應速率的重要指標[24]，同時反應通常在中性或弱堿性的條件下發(fā)生反應[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，控制反應過程中pH對生成的類黑精種類及結構有影響，Kwak等[27]發(fā)現(xiàn)在恒定pH條件下電聚焦生成的條帶數(shù)量小于緩沖溶液條件下生成的，但是恒定pH條件下生成的類黑精穩(wěn)定性更好。同時，研究發(fā)現(xiàn)，類黑精中不只有大分子化合物，也包括一些小分子化合物[4]。紫外-可見光譜可測量類黑精的特征吸收值，類黑精的吸收值在400～500 nm之間，吸光值與濃度成正比。現(xiàn)有的研究中，使用光學儀器等對其進行表征，類黑精中含有羥基、羰基、羧基等官能團；含有熒光物質，具有熒光特性[28]；熱降解后含有呋喃、羰基化合物、吡咯等物質。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，類黑精具有陰離子性[29]，帶負電荷[30]，可與金屬離子螯合[3]。類黑精具有很高的抗氧化活性，這可能與類黑精的陰離子負電性有關[22]。

2.1 紫外-可見光譜

紫外-可見光譜廣泛應用于物質的定性、定量分析，在類黑精的研究中也被廣泛使用。Wang等[8]測定模型類黑精200～800 nm紫外-可見吸收光譜，得到樣品在275 nm和375 nm處有吸收峰。時川[31]測定紅棗棗皮類黑精200～600 nm波長范圍內的吸收值，結果表明其在470 nm處有最大吸收峰。王月麗[18]測定黑蒜類黑精200～700 nm內吸收波長，結果顯示無明顯末端吸收波長。由于類黑精是一類復雜的分子量不同的化合物，故而不能用單一的特征吸收峰來表示。也有研究引入摩爾消光系數(shù)來表征類黑精的含量，用1 mol/L的葡萄糖發(fā)生美拉德反應后的吸光度來表示類黑精濃度。研究發(fā)現(xiàn)：在400～500 nm內，模型類黑精顏色與葡萄糖含量成正比[32-33]；現(xiàn)有的研究一般選用400、420、470或490 nm來表征美拉德反應末期類黑精含量[34-35]。綜上，紫外-可見光譜操作簡單快速，具有很高的實用價值，可以用來判斷類黑精的相對含量，但是由于類黑精是一個混合物，故而不能對其進行定量判斷。

2.2 傅里葉變換紅外光譜

不同植物源性類黑精紅外光譜表征如表3所示，紅外光譜可以檢測待測樣品中所含有的官能團，也可以比較相同官能團的變化，從而對樣品進行很好的分析。紅外光譜因掃描速度快、靈敏度高等優(yōu)點被廣泛應用于類黑精的結構鑒定中，同時，也應考慮到類黑精是一個復雜的混合物，易受元素相互干擾和重疊峰的影響。

表3 不同植物源性類黑精紅外光譜表征Table 3 Infrared spectral characterization of different melanoidins from plants

2.3 熒光光譜

熒光光譜是一種指紋鑒定技術，不同物質具有不同的熒光特性。趙林芬等[37]通過熒光矩陣光譜研究云南小粒咖啡中類黑精的熒光強度，結果發(fā)現(xiàn)，在10～80 ℃的溫度范圍內，其熒光強度與溫度成反比；pH在5～10范圍內，熒光強度較為穩(wěn)定；避光條件下，60 min內熒光強度不發(fā)生顯著變化，光照條件下，熒光強度與時間成反比；在濃度低于0.5 mg/mL時，熒光強度與濃度成正比，在濃度大于10 mg/mL時，熒光強度與濃度不相關。Zhao等[20]在激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長400～600 nm處檢測熒光光譜，結果表明，最佳吸收波長和發(fā)射波長分別為370 nm和480 nm，這與其他類黑精熒光特性一致，進而可以推測不同來源的類黑精可能含有相同的結構單元[8]。綜上，類黑精具有熒光特性，通過測定其發(fā)射出的一定波長的輻射，可以對樣品中物質進行定性定量分析。熒光光譜因靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡單等優(yōu)點被廣泛應用，同時，也應該考慮到容易受相互元素干擾和疊加的影響，在類黑精的檢測中由于含有多種物質因此不能進行定量分析。

2.4 氣相色譜-質譜分析

不同植物源性類黑精氣相色譜-質譜表征如表4所示。Zhao等[20]對高靜水壓處理得到的黑蒜類黑精溶液進行熱解-氣相色譜-質譜分析，鑒定出88種熱解產物，熱降解后的揮發(fā)性物質主要由呋喃、羰基化合物、吡咯、吡嗪和吡啶組成。Wu等[19]用氣相色譜-質譜對黑蒜樣品進行分析，結果表明：從類黑精樣品中共鑒定出26種揮發(fā)性化合物，其主要物質為雜環(huán)胺和含硫揮發(fā)性物質。綜上，氣相色譜-質譜可以根據(jù)出峰的特點對樣品中所含有的物質進行定性，因其樣品用量少和檢測靈敏度高，廣泛應用于類黑精的測定，但是，它只能對已經確定的物質進行檢測，不能檢測新物質，對于美拉德反應可能出現(xiàn)的新物質結構不能確定。

表4 不同植物源性類黑精氣相色譜-質譜表征Table 4 Gas chromatograph-mass spectrometer characterization of different melanoidins from plants

2.5 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡可表征大分子的納米結構構象，能夠以更加直觀的方式觀察物質的表面形態(tài)。Zhao等[20,43]用原子力顯微鏡（AFM）對高靜水壓處理黑蒜類黑素的形態(tài)進行了表征，結果表明：未經處理的類黑精表面粗糙度（Ra）為0.305 nm、最大高度（Rmax）為17.5 nm、偏斜度為8.11和峰度為114；高靜水壓處理增加了Ra和Rmax，減少了黑色素樣品的偏斜和峰度。王月麗[18]用AFM對不同分子量黑蒜類黑精形態(tài)進行表征，發(fā)現(xiàn)不同分子量類黑精有不同的形貌特征，有球狀、棒狀、環(huán)狀、圓錐狀等；其中中分子量在1～10 kDa多處形成明顯清晰的排列，呈不規(guī)則的團聚球狀結構，分子量在10～50 kDa組分在云母片表面形成網(wǎng)狀結構，多糖鏈呈卷曲旋轉狀。原子力顯微鏡可以直接得到待測樣品三維表面圖，且不需要特殊處理，對于類黑精的研究具有很高的參考價值，但也會受探頭的影響，并且有成像范圍小、速度慢的局限。

2.6 核磁共振掃描

核磁共振是由原子核的自旋運動引起的，不同的原子核自旋運動的情況不同，以此能夠實現(xiàn)對所含有的基團結構進行解析。王月麗[18]測定了黑蒜類黑精提取液核磁共振測1H和13C譜，結果表明：類黑精中含有豐富的糖類物質，糖殘基異頭碳含有α-型和β-型，糖環(huán)構型含有吡喃型和呋喃型。Mohsin等[40]借助核磁共振研究不同溫度下生成模型類黑精的結構區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，N-H、C-N和C-H振蕩的尖銳信號容易出現(xiàn)不均勻展寬，可能是生成的小分子殘基合并到大分子骨架的原因；碳含量隨著溫度的升高而增加，而氫和氧的含量則隨著溫度的升高而減少，失去的氫和氧的摩爾比約為2:1。Ripper等[7]利用核磁共振技術研究咖啡類黑精成分變化。研究發(fā)現(xiàn)，含有蛋白質和多糖，類黑精的分子量在烘焙期間先增加后減小，綠原酸可以保持完整結構通過化學鍵與咖啡類黑精共價鍵相連。Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)模型類黑精在美拉德反應過程中能夠轉化為熒光納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，類黑精在熱水中加熱會形成熒光納米顆粒，呋喃環(huán)的碳鍵斷裂，釋放出高碳氫比組分，如CH=CH-、-C≡C-和苯衍生物。核磁共振光譜通常用來結構解析，根據(jù)標記1H和13C所呈現(xiàn)的峰，對樣品實現(xiàn)完整結構解析，現(xiàn)已經廣泛應用于大分子物質的結構解析。但是，由于類黑精是一組復雜的化合物，不是單一的物質，因此其結構鑒定會不可避免地受雜峰的影響。

3 類黑精功能活性

隨著生活水平的不斷提高，人們對于飲食健康的要求提高，相比較單一關注食品的口感，更多的關注食品的健康以及營養(yǎng)均衡[44-45]。類黑精因廣泛存在于日常飲食中且具有其特殊的功能性質，受到人們越來越多的關注[46-48]。據(jù)估計，普通人群每天攝入大約10～12 g來自所有可能的食物來源的類黑精。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)類黑精具有多種有益人體健康的功能性質。同時，類黑精的攝入應當控制在一定的劑量范圍內，且不應過度夸大其作用，有研究發(fā)現(xiàn)，過量的類黑精可能有致敏、致突變、致癌的風險。下面對類黑精的細胞毒性、預防肥胖、改善腸道菌群、抗癌等功能作用進行綜述。

3.1 細胞毒性

目前研究類黑精細胞毒性的細胞系有人結腸癌細胞（CaCo-2細胞），人臍靜脈內皮細胞系（HUVEC細胞），LS180結腸癌細胞，小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7細胞），3 T3-L1 鼠成纖維細胞等。Noelia等[49]研究普通面包、軟面包和餅干中類黑精對于CaCo-2細胞和HUVEC細胞的細胞毒性作用，研究發(fā)現(xiàn)：軟面包中類黑精以及其模擬體外消化產物對兩種細胞系均不產生毒性作用；普通面包對于HUVEC細胞的細胞毒性存在劑量關系，類黑精樣品在100 μg/mL細胞毒性顯著，經過體外模擬消化類黑精樣品在200 μg/mL細胞毒性顯著，顯示細胞毒性隨劑量增加；餅干中的類黑精提取物對HUVEC細胞具有細胞毒性，但其經過體外模擬消化以后細胞毒性消失。Langner等[50]研究發(fā)現(xiàn)，從加熱的馬鈴薯纖維中分離的類黑精對體外培養(yǎng)的LS180結腸癌細胞有抗增殖作用，與馬鈴薯纖維提取物和高分子量類黑精相比，低分子量類黑精顯示出明顯更強的改變特定分子靶點的潛力。

3.2 預防肥胖

肥胖是一個主要的公共衛(wèi)生問題，可導致額外的代謝綜合征，如脂肪肝、血脂異常、糖尿病、高血壓和動脈硬化。Wu等[51]以高脂飲食誘導的小鼠為研究對象，通過口服不同濃度的黑蒜類黑精提取液，研究類黑精對于肥胖的調節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)：口服黑蒜類黑精提取液的小鼠體重和白色脂肪組織明顯降低，且高劑量組具有更好的效果；明顯緩解血脂紊亂，促進脂質代謝，增加糖耐量。Eriko等[52]從黑醋中提取一種新型寡葡聚糖-類黑精，發(fā)現(xiàn)其對3 T3-L1小鼠成纖維細胞成脂具有顯著抑制作用。Sara等[5]研究黑蒜提取物對高脂高糖飲食誘導的雄性大鼠代謝作用影響，發(fā)現(xiàn)：黑蒜提取物可促進小鼠機體代謝，促進基因表達和瘦素受體mRNA水平降低，從基因層面證明黑蒜的預防肥胖，促進代謝作用。Wu等[53]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量晚期糖基化產物會改變腸道菌群，不利于碳水化合物和脂質的代謝；而低劑量的晚期糖基化產物會促進代謝，阻止或者逆轉早期糖尿病的進程。由此可知，一定劑量的類黑精可以達到預防小鼠肥胖的效果，類黑精對于人體是否具有預防肥胖的效果還有待進一步的科學研究。

3.3 改善腸道菌群

腸道菌群被稱為是“人類的第二大腦”，“被遺忘的器官”以及“人類的第二基因組”。越來越多的研究表明，腸道菌群與人體健康息息相關。Wu等[51]通過對C57BL/6小鼠盲腸提取物的細菌進行16S rRNA基因測序，研究微生物菌群的豐富度和多樣性，發(fā)現(xiàn)：腸道微生物環(huán)境得到改善，阿克曼氏菌科、乳酸桿菌科、埃格特菌科等增加，瘤胃菌科、弧菌科、坦納菌科等減少。Wu等[54]通過對高脂飲食小鼠灌喂不同分子量黑蒜類黑精溶液，研究黑蒜類黑精對高脂飲食誘導的晝夜腸道菌群失調的作用，研究發(fā)現(xiàn)：高分子量和低分子量的類黑精均能緩解高脂飲食引起的晝夜菌群失調，并且高分子量組相較于低分子量組具有更好的效果。Perez-burillo等[55]研究不同食物來源的類黑精對腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)：類黑精可以不被胃腸消化而成為腸道微生物發(fā)酵作用底物，增加短鏈脂肪酸的產生，促進雙歧桿菌等有益菌的生長，釋放酚類物質并促進其吸收；類黑精被認為是潛在的益生元制劑。

3.4 抗癌作用

癌癥是全世界疾病死亡率上升的一個主要原因，造成嚴重的社會負擔。Wang等[56]研究黑蒜提取液對小鼠免疫力產生的作用，發(fā)現(xiàn)注射黑蒜提取液的腫瘤細胞治愈率為50%，并且未治愈的腫瘤細胞大小是對照組的一半；注射黑蒜提取液的小鼠脾細胞中IFN-?、TNF-α、IL-2細胞因子分泌量增加，促使自然殺傷細胞活性明顯增強。Langner等[50]從烤馬鈴薯中分離出高分子量和低分子量的類黑精并作用于人類結腸癌細胞，發(fā)現(xiàn)高分子量和低分子量的類黑精提取液對結腸癌細胞均有抗增殖作用，其中低分子量組分效果優(yōu)于高分子量組分。

4 結論與展望

類黑精是美拉德反應后期一種特殊的功能分子，具有預防肥胖、改善腸道菌群、抗癌等功能性質。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)過量的類黑精會有致癌作用。美拉德反應發(fā)生在我們飲食的方方面面，加熱高溫都會促使其反應的發(fā)生，因此隨著人們飲食安全意識的不斷提高，越來越重視食品安全。就目前的發(fā)現(xiàn)，一部分研究通過葡萄糖和特定的氨基酸反應來簡化美拉德反應過程，減少不可控因素；一部分研究通過提取具體的食品中類黑精，對其結構及功能性質進行研究。類黑精廣泛存在于我們日常飲食，因此對于其安全性的研究非常重要，只有了解劑量-效應的關系，才能讓其更好的發(fā)揮有益作用。同時，類黑精作為美拉德反應產物，通過對它的研究，有助于美拉德反應機理的研究。在未來對于類黑精的研究，希望可以通過新的檢測技術進一步解析其內部結構及功能基團和組合方式，同時，通過動物學實驗研究其有害作用的劑量-效應關系，以便更好的造福人類。