犢牛感染性腹瀉的流行現狀及綜合防控

賈麗，武英豪，李燕，張建偉，彭清潔，鑫婷，張廣智，馬玉忠，丁家波*

(1. 河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071000；2. 中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3. 北京市畜牧總站，北京 100193；4. 安琪酵母股份有限公司生物農業技術中心，湖北 宜昌 443000；5.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

感染性腹瀉是由病毒、細菌和寄生蟲等病原所致。國內外研究認為，牛冠狀病毒(BCoV)、牛輪狀病毒(BoRVA)、大腸桿菌(E.coli)和隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的主要病原[1]。犢牛感染性腹瀉發病率在80%左右，臨床可見患病犢牛排出白色腹瀉物或黃色稀便。如何有效防控犢牛感染性腹瀉是目前亟待解決的問題。本文就犢牛感染性腹瀉的病原、流行特點、檢測、預防和治療等方面論述，旨在為該病的綜合防控提供參考。

1 病毒性病原

1.1 牛輪狀病毒A

本病毒易感染30日齡及以下的犢牛，病死率高達100%[2]。輪狀病毒的外衣殼由VP7和VP4蛋白組成，這兩種蛋白分別含有G、P基因型。數據表明，目前至少有41種G基因型和57種P基因型出現，G6、G8、G10與P[1]、P[5]、P[11]，G6P[5]、G6P[11]、G10P[11]較為流行，其中，我國大部分地區主要流行的病毒優勢變異基因型為G6P[1][3]。目前，針對牛輪狀病毒研究出一種即用型液體牛-人重組五價輪狀病毒疫苗已經在印度獲得了使用許可，并在2018與2019年分別在印度通過了成人和嬰兒的安全性與耐受性試驗[4]。全基因組測序常用來作為研究BoRVA發病機制而被使用。在BoRVA感染MA104細胞后，通過使用Illumina RNA測序發現在發生變化的160個差異表達基因中有28個靶向mRNA參與相應靶細胞機制和免疫調節途徑，利用這種方法能夠更加全面地探究與病毒感染機制相關的基因，為抗病毒研究提供條件[5]。近期，依據雙抗體夾心原理研發了一種用于鑒定BoRVA的膠體金免疫層析試紙，以膠體金標記的純化單克隆抗體作為檢測線，將山羊抗小鼠抗體和純化的多克隆抗體分別包被在硝酸纖維素膜上作為對照線和測試線，通過優化各種條件，能更加高效準確進行BoRVA檢測[6]。

1.2 牛冠狀病毒

犢牛通常在冬季和較為寒冷地區最易受到BCoV侵襲，但近些年在溫暖季節或熱帶地區BCoV導致犢牛腹瀉流行的情況同樣嚴重，出現這種現象的原因可能與分離株中的受體破壞酶(RDE)相關[7]。本病毒流行范圍廣，在養殖規模較大的國家檢出率較高[8]；國內感染主要集中在西南地區[9]。α和β冠狀病毒主要感染哺乳動物，牛冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-OC43、HECoV-44同屬于β冠狀病毒，且由于同一親本在多次基因重組和種間傳播后發生突變導致感染哺乳動物的同屬病毒之間具有密切的遺傳相關性[10]。研究表明，BCoV會根據自身嗜性在免疫環境產生的競爭性壓力下進行不斷變異，而這種嗜性又與氨基酸不斷變化相關，不同重組毒株會出現相同的氨基酸突變體[11]。在檢測方面，Geng等[12]研究出一種比傳統PCR具有高特異性和靈敏性的三重qRT-PCR，通過使用三重特異性探針，設定最佳退火溫度，在同步檢測BPV、BCoV和BPIV方面體現了更加優越的靈敏度。另外，據報道新冠肺炎病原SARS-CoV2與BCoV親緣關系相近且兩者存在共同表位，使用抗牛冠狀病毒免疫乳進行免疫可以降低SARS-CoV2感染[13]。

1.3 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)

目前發現BVDV有21種A亞型(BVDV 1a～u)、4種B亞型(BVDV 2a～d)和4種H亞型(BVDV 3a～d)。A亞型流行范圍廣，印度尼西亞和中國西部流行1a和1c；B亞型主要分布在美洲、部分歐洲國家和亞洲。在日本，除1b亞型外，2a亞型感染情況較嚴重，占27.7%。我國福建省BVDV檢出率最高，可達90.0%[14-15]。BVDV在妊娠早期穿過胎盤進行感染，出生犢牛轉變為持續感染(PI)牛，PI牛難以凈化，終生帶毒與排毒，最終成為BVDV的主要傳染源[17]。目前，許多國家為控制傳染主要依靠篩查和消滅PI牛。應用標記或DIVA疫苗有助于推動流行地區根除計劃[18]。研究人員通過組裝二聚化E2和Erns蛋白制備了BVDV病毒樣顆粒(BVDV-VLPs)，這種VLPs可以顯著升高免疫細胞表達水平，增加機體對抗病毒的能力[19]。一般來說通過傳統遺傳表征的方法無法準確分析病毒間的遺傳關系，利用多變量分析可視化中和測定結果能更好地表征具有較小抗原差異的同種分離株之間的抗原關系[20]，為研究病毒的遺傳多樣性提供了更可靠的方法。

2 細菌性病原

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌包含6種致瀉型菌株，其中產腸毒素大腸埃希菌(ETEC)和產志賀毒素大腸埃希菌(STEC)最常見，且攜帶志賀毒素基因stx1和stx2、腸毒素基因lt和sta、毒力基因eaeA和f41的大腸桿菌具有更強的感染能力[21]。研究發現，致犢牛腹瀉的STEC O80：H2型大腸桿菌對人類致病能力輕微，但兩者攜帶的基因型相近，感染能力的差異可能與機體本身的抗感染能力有關[22]。Bashir等[23]使用使用銀納米粒子(Ag NPs)為表面增強拉曼光譜散射(SERS)底物，通過比較特定菌株的SERS光譜，對鑒別大腸桿菌碳青霉烯類耐藥菌株能達到100%的特異性和準確性。為了在初乳中獲得最大水平的母源抗體，在母牛分娩前至少8周進行最后一次接種并在出生最初幾周連續給予母乳或免疫乳，可提高犢牛局部腸道免疫能力以預防腹瀉[24]。研究顯示，在犢牛斷奶后聯合補充HNa和谷氨酰胺(Gln)可有效改善犢牛的免疫抗氧化能力，增加腸道菌群豐度，緩解因腹瀉帶來的腸道菌群紊亂與致病菌大量增殖的可能[25]。如今，菌株耐藥能力加強，替抗產品的開發變得十分關鍵。He等[26]發現，熊去氧膽酸(UDCA)能通過TGR5-NF-κB軸在體外和體內阻斷細菌生長和侵襲，增強新生奶牛對腹瀉的抵抗力，起到緩解結腸炎的作用。

2.2 沙門菌

沙門菌是一種無差別感染人和各種動物的食源性病原體。蠅類和野生動物是沙門菌的重要攜帶和傳播者[27]。毒力因子能夠幫助細菌侵入細胞并逃避免疫系統的捕捉，本菌含有17個毒力島(SPI)，其中SPI-1～SPI-5主要存在于腸炎沙門菌中，其中inv、sip、hil與腸炎沙門菌的侵襲密切相關[28]。通過使用隨機擴增多態性DNA技術(ERIC-PCR)可以實現對沙門菌進行準確基因分型，有利于變異菌株的正確識別與流行情況的監管[29]。此外，在犢牛接種沙門菌疫苗期間使用“Roncoleukin”(一種免疫刺激劑)和蜂膠乳，可以使機體形成特異性主動免疫反應，增加動物體內的抗體滴度[30]。對于沙門菌引起的犢牛腹瀉，應盡早使用敏感藥物進行治療。使用抗生素治療可將死亡率降低到10%，而未經治療的動物的死亡率則為75%[31]。在益生菌的應用方面，保加利亞德氏乳桿菌與長雙歧桿菌BL-15955聯用能夠下調沙門菌毒力fanC、fim41a、estAde的表達，從而起到預防沙門菌感染造成犢牛腹瀉的作用[32]。

2.3 產氣莢膜梭菌

產氣莢膜梭菌根據毒素和致病力的差異可分為A～E型，毒性由其毒素和降解酶介導，主要包括：α(CPA)、 β(CPB)、 ε(ETX)、 I(CPI)、 β2(CPB2)和腸毒素(CPE)等[33]。一般單一菌株無法完全產生這些毒素，導致菌株之間存在致病力差異。犢牛是否被感染與年齡和性別無關[34]。A型產氣莢膜梭菌以腸壞死和出血為特征，存在于正常的腸道微生物菌群中不易進行診斷；B型主要含有β毒素，易被胰蛋白酶破壞，因此B型產氣莢膜梭菌通常僅引起新生反芻動物發?。籆型導致的急性出血性腹瀉主要與動物攝入的大量可溶性碳水化合物和/或蛋白質有關[35]；D型菌株在犢牛腹瀉病例中很少見，但會致犢牛出現神經癥狀，而腸道病變不顯著[36]。現階段主要有天然產氣莢膜梭菌毒素疫苗和甲醛滅活毒素疫苗，接種前者犢牛所獲抗體效價較高，接種后者免疫應答較為多變。但使用任何一種疫苗制劑對犢牛進行免疫都會引起抗體反應[37]。由于傳統疫苗的局限性，Jiang等[38]通過將產氣莢膜梭菌α、β和ε的無毒重組類毒素rCPA247-370、rCPBrETxHP在大腸桿菌中表達研究出了一種重組類毒素疫苗，這種疫苗能夠顯著提高IgG抗體水平，加強機體抗此菌感染的能力。

3 寄生蟲性病原

3.1 球蟲

我國有19種牛球蟲，其中牛艾美耳球蟲(Eimeriabovis)和邱氏艾美耳球蟲(Eimeriazuernii)在犢牛腹瀉中較為普遍且致病能力強[39]。秋季多雨季節流行率較高，主要寄生在牛的腸道細胞內，在土壤、植被或水中可以生存數月。我國牛艾美耳球蟲感染率為40%左右，且在南方的患病率高，犢牛多因吸吮受糞便污染的乳房而感染并且飼養密度越大傳播速度越快[40]。觀察孢子囊數目和孢子體的分布是鑒別球蟲感染公認的方法。如今，研究人員已經開發出一種針對艾美耳球蟲特定ITS-1區的特殊變異序列進行擴增的PCR方法，不但可以區分艾美耳球蟲，在鑒定高致病性艾美耳球蟲方面同樣具有較高的靈敏性[41]。另外，通過使用納米技術對常山酮進行封裝可以很好的提高藥物的生物效應，從而在減少給藥劑量與毒性作用的同時，增強藥物內化，減少腸道細胞凋亡，幫助恢復腸道微生物群來治療球蟲病[42]。

3.2 隱孢子蟲

隱孢子蟲常與其他病原進行混合感染，在犢牛腹瀉中，由隱孢子蟲單獨感染或與其他病原混合感染引起的腹瀉已超過50%[43]。到目前已發現40種隱孢子蟲，其中小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲最常見，可以根據18S rRNA基因序列分析對這4種隱孢子蟲進行區分[44]。為了方便對其進行檢測，Yao等[45]針對隱孢子蟲cgd3_330基因特殊序列區域建立了一種更加便捷的納米PCR檢測法，通過測試發現這種納米PCR檢測的靈敏度比普通PCR檢測高10倍，為檢測小隱孢子蟲提供了方法。盡管我國在隱孢子蟲的研究方面取得了進展，但在隱孢子蟲病的實地研究中仍缺乏先進的分子診斷工具，無法很好地跟進綜合性流行病學調查。研究證明，在犢牛出生前5 d直接使用常山酮進行預防性治療后可以觀察到卵囊脫落明顯減少，犢牛腹瀉和死亡率顯著降低，機體抵抗力提升后也能較少地受到其他病原的侵襲[46]。

3.3 賈第鞭毛蟲(Giardia)

賈第鞭毛蟲是已知唯一一種以抗原變異機制逃避宿主免疫的人畜共患原蟲，牛是人源性賈第鞭毛蟲的重要宿主之一。卵囊主要通過水源進行傳播，隨著土壤濕度增加，檢出的卵囊數量也會增加[47]。賈第鞭毛蟲的基因型分為A～H，A和E組合主要感染牛，E3在中國分布最廣。如今，普遍采用谷氨酸、脫氨酶(gdh)和磷酸丙糖異構酶(tpi)基因進行賈第鞭毛蟲多位點基因分型。這3種基因中，bg基因的變異性最大，可以用來檢測基因的遺傳多樣性。ssu基因具有高度保守性，可用于樣品中賈第鞭毛蟲的鑒別[48]。研究顯示，給犢牛每次口服10 mg/kg塞克硝唑可以100%減少賈第鞭主蟲的排泄，說明此藥對治療賈第鞭毛蟲感染能起到比較理想的效果[49]。

4 綜合防控

在全世界引起犢牛腹瀉的病原多種多樣，除了常見病原外，牛星狀病毒、牛圓環病毒、牛諾如病毒、牛腸道病毒、牛細小病毒等也會致犢牛腹瀉[50]。不同病原由于毒力不同，當病原發生混合感染或進行基因型變異時，疫苗就需要及時進行更新。豐富的疫苗種類主要得益于新靶點的發現與技術的更新。疫苗在一定程度上可以提高犢牛獲得抗體的滴度，激發保護機制。另外，研制高效的抗菌素替代品，如飼喂釀酒酵母培養物、益生菌、益生元、發酵代乳粉與超免疫初乳等都可以在一定程度上起到降低犢牛腹瀉發病率的作用。在廢奶管理方面，雖然有研究證明經消毒的廢奶營養成分優于濃縮飼料，但巴氏滅菌法無法祛除廢奶中的殘留抗生素，不但致耐藥菌增多，還會干擾腸道微生物菌群和免疫細胞的分化。

犢牛會因病原體的侵襲、環境的變化或機體抵抗力降低等誘發感染性腹瀉。如今，國內大型養殖場對于犢牛的生長環境、飼喂條件等管理更加專業智能化，犢牛島區域的合理規劃有利于改善犢牛的居住與運動條件，降低腹瀉的發生。另外，犢牛在被運輸的過程中常發生運輸應激，這會導致機體免疫力下降，從而為病原入侵提供了條件[51]。因此，應將各項運輸前后的管理列為犢牛綜合養殖的考慮范圍，提高犢牛養殖方面的廣度和深度認識。

在防治犢牛腹瀉方面使用抗生素結合支持療法出現了較明顯副作用，這種方法造成了細菌耐藥性和藥物殘留問題且臨床治療效果不夠理想。同樣，中獸藥在治療上也存在著一定局限性，因為大多方劑的使用還停留在傳統階段，所以開發新制劑成為近年來的熱點。集約化和標準化發展是趨勢，犢牛感染性腹瀉的防治對經濟發展有十分重要的意義。需要采取更加嚴格科學的綜合性防治措施，以便更好地進行畜牧養殖生產。