西瓜蔓枯病抗性遺傳、基因定位及育種研究進(jìn)展

程 瑞， 王學(xué)征， 徐兵劃， 張朝陽(yáng)， 黃大躍， 白 甜， 羅德旭， 孫玉東

(1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/淮安市設(shè)施蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安 223001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

西瓜蔓枯病(gummy stem blight of watermelon，GSB)是一種世界性真菌病害，病原菌為Stagonosporopsisspp.，包含S.caricae及其演生的姊妹種S.citrulli和S.cucurbitacearum(Didymellabryoniae)3種病原菌，這3種病原菌在形態(tài)上無(wú)明顯差異，需要通過(guò)基因型進(jìn)行區(qū)分[1-3]。據(jù)報(bào)道，蔓枯病病原菌不僅在全球范圍內(nèi)分布廣泛，并且能危害多種葫蘆科作物[4]，包括西瓜[5]、甜瓜[6]、黃瓜[7]、南瓜[8]等，該病原菌主要通過(guò)土壤、灌溉等途徑傳播，高溫高濕環(huán)境更有利于病原菌孢子的存活和擴(kuò)散，相應(yīng)病害在西瓜的整個(gè)生育期均可發(fā)生，莖蔓、葉片是最主要的發(fā)病部位，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)侵染果實(shí)[9]。近年來(lái)，隨著我國(guó)溫室大棚等設(shè)施栽培的快速發(fā)展，人們長(zhǎng)期進(jìn)行的多茬次栽培，不僅會(huì)造成農(nóng)業(yè)生態(tài)條件的惡化和植物自毒作用，引發(fā)植株生長(zhǎng)代謝障礙與抗逆性減弱，同時(shí)土壤中蔓枯病病原菌基數(shù)也急劇增加，加上高溫高濕環(huán)境有利于蔓枯病病原菌快速繁殖，導(dǎo)致在西瓜生產(chǎn)實(shí)踐中暴發(fā)大面積蔓枯病[3，9]。相關(guān)研究顯示，西瓜蔓枯病病株率一般為15%～25%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%以上，能在短時(shí)間內(nèi)使植株藤蔓枯死，病蔓率達(dá)10%，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可減產(chǎn)15%以上，且該病發(fā)病快，一旦發(fā)生便很難控制，從而嚴(yán)重影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，目前已經(jīng)發(fā)展成為西瓜生產(chǎn)上的主要病害，嚴(yán)重制約了我國(guó)西瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[10-12]。目前，防治西瓜蔓枯病以化學(xué)藥物為主，但因該病害在西瓜生產(chǎn)的各個(gè)生育期均可發(fā)生，并且能夠侵害西瓜植株的不同部位，加上該病原菌的寄主分布廣泛且結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，從而嚴(yán)重影響了該病害的防治效果[13-15]。同時(shí)，化學(xué)防治不僅成本高、效率低，還會(huì)引起病原菌的抗藥性及環(huán)境污染等問(wèn)題[16]。利用抗病品種是防治西瓜蔓枯病最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施。育種家們一直在進(jìn)行西瓜蔓枯病抗源篩選和利用的研究，但是由于西瓜經(jīng)長(zhǎng)期馴化，致使其遺傳背景狹窄，由于抗性材料多為野生種質(zhì)，且病原菌分布廣泛、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、目前西瓜蔓枯病的抗性遺傳機(jī)制尚不清晰等[17-22]，使得采用傳統(tǒng)育種方法難以培育出優(yōu)質(zhì)抗病品種。因此，至今都未見(jiàn)可用于生產(chǎn)的蔓枯病抗性西瓜新品種。隨著西瓜基因組和重測(cè)序數(shù)據(jù)的公布及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于病原菌研究[22-24]，近年來(lái)育種家們?cè)谖鞴下莶】剐澡b定、遺傳分析、基因/數(shù)量性狀座位(QTL)定位及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面開(kāi)展了許多工作，也取得了很大進(jìn)展。本文著重就近5年的研究進(jìn)行總結(jié)，旨在為西瓜蔓枯病抗性育種提供參考。

1 西瓜蔓枯病病原菌的研究

掌握病原菌的特征、分布是利用抗性材料進(jìn)行抗病育種的重要依據(jù)。1891年，Chester在美國(guó)特拉華州的西瓜植株上發(fā)現(xiàn)西瓜蔓枯病病原菌并將其命名為PhyllostictacitrullinaChester，是在西瓜上發(fā)現(xiàn)該病原菌的最早記錄[5]。研究發(fā)現(xiàn)，蔓枯病病原菌存在有性世代、無(wú)性世代2個(gè)部分，且在全球分布廣泛，前人主要通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行獨(dú)立區(qū)分和命名，導(dǎo)致蔓枯病病原菌命名比較混亂[25]，最后統(tǒng)一學(xué)名為D.bryoniae。直到2015年，Stewart等首次在前人研究的基礎(chǔ)上明確了3種蔓枯病致病菌并重新對(duì)其進(jìn)行命名劃分：S.caricae及其演化生成的姊妹種S.citrulli、S.cucurbitacearum(D.bryoniae)，這3種病原菌形態(tài)相似，但基因型存在差異，可以通過(guò)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分[1-2]。

西瓜蔓枯病自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直呈現(xiàn)出擴(kuò)大蔓延的暴發(fā)趨勢(shì)，如今已廣泛分布于南美洲、亞洲、歐洲、非洲及大洋洲等地區(qū)[26]。近年來(lái)，研究者們對(duì)各地區(qū)西瓜蔓枯病病原菌進(jìn)行了調(diào)查分析。Stewart等對(duì)北美、南美、歐洲、北非和亞洲等地區(qū)的蔓枯病病原菌進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，在北美、南美、亞洲和東南亞等地區(qū)分布的主要為S.caricae，而S.cucurbitacearum則主要來(lái)自北美、歐洲、亞洲和新西蘭的溫帶地區(qū)[1]。在美國(guó)境內(nèi)，S.citrulli為優(yōu)勢(shì)種，主要分布在美國(guó)東南部，S.cucurbitacearum在美國(guó)東北部更為常見(jiàn)[27]。2014年，Li等對(duì)我國(guó)華東地區(qū)西瓜蔓枯病害進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，D.bryoniae是引發(fā)我國(guó)華東地區(qū)西瓜蔓枯病病害的主要病原菌[28]。基于Stewart等對(duì)蔓枯病病菌最新的分類方法[1]，徐彥剛對(duì)我國(guó)江蘇、安徽、浙江、江西地區(qū)西瓜蔓枯病發(fā)病植株進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)致病菌均為S.citrulli[20]。譚蕊對(duì)我國(guó)西南地區(qū)西瓜蔓枯病病原菌進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)西南地區(qū)西瓜蔓枯病的致病菌主要為S.citrulli、S.caricae2種，未見(jiàn)S.cucurbitacearum，其中S.citrulli是該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種[25]。Huang等對(duì)我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)西瓜蔓枯病病原菌進(jìn)行鑒定統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，S.citrulli是引發(fā)臺(tái)灣地區(qū)西瓜蔓枯病的主要病原菌[29]。近2年，Wang等以及筆者所在團(tuán)隊(duì)從田間分離西瓜蔓枯病發(fā)病植株發(fā)現(xiàn)，我國(guó)浙江、江蘇地區(qū)西瓜蔓枯病致病菌主要為S.cucurbitacearum[30]。以上研究結(jié)果表明，西瓜蔓枯病的3種病原菌在全球廣泛存在，不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種存在差異，而我國(guó)西瓜蔓枯病病原涵蓋以上3種，且不同地理區(qū)域、不同年份的優(yōu)勢(shì)種群可能不同。

在病原菌遺傳多樣性及致病力方面，研究者們也開(kāi)展了一系列研究，但是由于生物學(xué)技術(shù)及測(cè)序技術(shù)的限制，前人的研究結(jié)論多數(shù)認(rèn)為蔓枯病病原菌遺傳多樣性較低[31-34]，并且不同病原菌菌株之間的致病力差異不顯著[35-36]。近年來(lái)，人們對(duì)蔓枯病病原菌的研究不斷深入，Gimode等對(duì)6份從不同寄主上分離獲得的蔓枯病菌(S.cucurbitacearum、S.citrulli、S.caricae每種各2份不同分離菌株)分別通過(guò)苗期接種鑒定的方式進(jìn)行病原菌致病性、西瓜種質(zhì)蔓枯病抗性研究，接種12份不同西瓜種質(zhì)資源的結(jié)果表明，西瓜蔓枯病病原菌的侵染性水平不僅與菌種有關(guān)，不同分離菌株的侵染力也存在明顯差異；西瓜種質(zhì)對(duì)蔓枯病病原菌株的抗性也存在不確定性。另有研究發(fā)現(xiàn)，不僅不同來(lái)源的蔓枯病致病菌株的致病力存在差異，同時(shí)對(duì)殺菌劑的敏感性也顯著不同[37-39]。S.caricae對(duì)戊唑醇類殺菌劑存在耐藥性，而S.citrulli、S.cucurbitacearum則對(duì)這類殺菌劑敏感[37]；S.caricae對(duì)啶酰菌胺類和氟吡菌酰胺類殺菌劑敏感，但S.citrulli對(duì)該類殺菌劑具有一定抗性[38]；在我國(guó)東部發(fā)現(xiàn)的S.citrulli對(duì)甲基硫菌靈具有一定抗性，而在美國(guó)弗羅里達(dá)州分離的S.citrulli卻對(duì)甲基硫菌靈敏感[39]。西瓜蔓枯病病原菌菌株間的致病力、耐藥性存在差異，西瓜種質(zhì)對(duì)蔓枯病病原菌的抗性具有不確定性，這些都給西瓜蔓枯病的防治和抗性品種選育帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。雖然目前關(guān)于西瓜蔓枯病病原菌致病機(jī)制、不同病原菌及菌株之間的差異特性尚不清楚，但是人們近2年對(duì)蔓枯病病原菌的研究不斷深入，如浙江大學(xué)宋鳳鳴老師團(tuán)隊(duì)完成了從浙江地區(qū)分離獲得的西瓜蔓枯病病原菌S.cucurbitacearum分離株DBTL4的基因組測(cè)序工作，共獲得35.28 Mb基因組數(shù)據(jù)和 9 844 個(gè)預(yù)測(cè)蛋白[30]，并在NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中公布了全部數(shù)據(jù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/taxonomy/749889/)，這將有助于研究者更全面地了解蔓枯病病原菌。

2 抗性種質(zhì)、遺傳分析和基因/QTL定位

西瓜蔓枯病抗性種質(zhì)資源主要集中在野生西瓜(Citrullusamarus)中，通過(guò)傳統(tǒng)雜交方式選育抗性西瓜品種不僅周期長(zhǎng)，而且不確定性高。近年來(lái)，育種工作者通過(guò)人工接種方式進(jìn)行西瓜蔓枯病抗性資源評(píng)價(jià)鑒定、抗性遺傳分析研究，并積極開(kāi)展抗性基因/QTL定位及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)研究，有關(guān)西瓜蔓枯病抗性的定位研究主要以S.cucurbitacearum(D.bryoniae)和S.citrulli2種病原菌為研究對(duì)象，并且各地研究病原的菌株以當(dāng)?shù)胤蛛x菌株為主。雖然起步較晚，但近2年已成為研究熱點(diǎn)，并取得積極進(jìn)展。

2.1 抗性種質(zhì)鑒定

在長(zhǎng)期馴化的過(guò)程中，因過(guò)于重視果實(shí)品質(zhì)，導(dǎo)致一些性狀損失，并導(dǎo)致栽培西瓜的遺傳基礎(chǔ)非常狹窄，其他瓜類品種已被用作西瓜多種病害抗性性狀的主要來(lái)源[22-24，40]。早在1962年，Sowell和Pointer就發(fā)現(xiàn)了抗蔓枯病的西瓜種質(zhì)PI 189225[41]，隨后育種家們?cè)噲D將這種抗性引入商業(yè)品種中，但未成功[42-47]。后來(lái)，PI 271778被確定為另一個(gè)西瓜蔓枯病抗性的來(lái)源[48]。2005年，PI 164248、PI 244019、PI 254744、PI 271771、PI 279461、PI 296332、PI 482276、PI 482379、PI 490383和PI 526233被鑒定為新的西瓜蔓枯病抗性種質(zhì)資源[49]。我國(guó)對(duì)西瓜蔓枯病抗性種質(zhì)資源的鑒定工作起步較晚，顧衛(wèi)紅等通過(guò)苗期接種鑒定，獲得美國(guó)引進(jìn)提純的Al-l golden producer、Al-l sweet scarlet和自育的新品系A(chǔ)5-6、H2-5等4個(gè)西瓜種質(zhì)對(duì)蔓枯病具有較強(qiáng)抗性[17]。宋榮浩等對(duì)78份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行蔓枯病抗性評(píng)價(jià)，未發(fā)現(xiàn)有免疫或高抗種質(zhì)，獲得AU-sweet scarlet、AU-Jubilant、AU-Producer及自交系W6-9、W23-18和W23-47等中抗西瓜蔓枯病種質(zhì)資源[18-19]。徐彥剛等對(duì)80份不同地域來(lái)源的西瓜種質(zhì)進(jìn)行蔓枯病接種抗性鑒定，篩選出21份高抗、抗西瓜蔓枯病種質(zhì)材料，其中僅PI 189225、PI 482276被鑒定為高抗材料[20-21]。綜合前人的研究結(jié)果，西瓜蔓枯病抗性主要來(lái)源于野生西瓜種C.amarus(表1)，通過(guò)雜交轉(zhuǎn)育方式獲得部分西瓜新品種(系)，但因地域、氣候條件、病原菌菌種等的不同在田間抗性表現(xiàn)并不穩(wěn)定[3，9]。盡管有上述的抗性來(lái)源，但抗蔓枯病西瓜品種的育種研究并不成功。蔓枯病可由3種不同病原菌引起，宿主對(duì)不同菌株的不同抗性存在差異、不同病原菌菌株致病力及耐藥性不同可能是部分抗性育種工作不成功的主要原因之一。

表1 西瓜抗蔓枯病資源

2.2 抗性遺傳分析

蔓枯病可在葫蘆科多種作物上發(fā)生，目前研究者已經(jīng)在西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜等多種葫蘆科作物上開(kāi)展了蔓枯病抗性遺傳和基因/QTL定位研究[9]，但西瓜蔓枯病抗性遺傳研究較為滯后，遺傳機(jī)制尚不明晰。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，西瓜蔓枯病抗性遺傳特性極為復(fù)雜，不僅不同品種(系)之間存在不同的遺傳特性，同時(shí)該特性還受到寄主、病原及環(huán)境條件等因素的協(xié)同影響[50]。Norton等通過(guò)將西瓜抗性種質(zhì)PI 189225與感病品種Charleston Gray進(jìn)行雜交，根據(jù)F2代及BC代群體的抗性表現(xiàn)，得出西瓜蔓枯病抗性基因是由1對(duì)隱性基因(db、db)控制的[44]。顧衛(wèi)紅等通過(guò)將西瓜抗蔓枯種質(zhì)與栽培易感品種雜交，根據(jù)后代抗性表型分析結(jié)果，認(rèn)為西瓜蔓枯病抗性遺傳為顯性基因控制[17]。Gusmini等通過(guò)不同抗性水平的西瓜品種雜交，根據(jù)F1、F2代和BC群體的抗性特性，認(rèn)為西瓜對(duì)蔓枯病的抗性受遺傳、非遺傳因素的共同影響，并且存在較大的環(huán)境影響和基因修飾[15]。全球有多位研究者分別獨(dú)立試驗(yàn)，以抗性西瓜種質(zhì)和易感材料雜交獲得F2(F2：3)代群體，并以苗期人工噴霧西瓜蔓枯病病原菌懸浮孢子液的方式進(jìn)行接種抗性鑒定，結(jié)果均表明，西瓜對(duì)蔓枯病的抗性遺傳屬于數(shù)量性狀，且受環(huán)境等因素的影響較大[51-54]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，蔓枯病的抗性在西瓜中存在顯著的變異性[49，55]。西瓜種質(zhì)資源作為抗蔓枯病育種和有關(guān)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，需要不斷完善種質(zhì)資源遺傳多樣性的評(píng)價(jià)體系，明確西瓜種質(zhì)遺傳多樣性的分布特點(diǎn)。

2.3 基因/QTL定位

雖然西瓜蔓枯病抗性遺傳分析的工作起步于40年前，但對(duì)抗性基因/QTL定位研究則是近幾年的事。如上所述，目前在主要研究區(qū)域的優(yōu)勢(shì)種為S.cucurbitacearum(D.bryoniae)和S.citrulli，因此，主要研究工作集中在抗這2種菌種的遺傳分析和基因/QTL定位上。Ren等以抗性種質(zhì)PI 189225(C.amarus)為父本、易感西瓜品種K3(C.lanatus)為母本進(jìn)行雜交，獲得264個(gè)F2代株系和211個(gè)F2：3代株系，在2016年春、秋2季分別于苗期進(jìn)行噴霧接種抗性鑒定[51]，所用病原菌為我國(guó)華東地區(qū)優(yōu)勢(shì)種S.cucurbitacearum分離株JS002。結(jié)果表明，西瓜蔓枯病抗性遺傳為隱性數(shù)量性狀。采用BSA測(cè)序分析方法定位到8號(hào)染色上1個(gè)約5.7 Mb大小的主效位點(diǎn)QTL8.1，解釋了31.54%～32.42%的表型變異(表2)。通過(guò)開(kāi)發(fā)KASP分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，將候選區(qū)間縮至KASP_JS9383和KASP_JS9186標(biāo)記之間(571.27 kb)(表3)，以西瓜97103 v1為參考基因組，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)有19個(gè)注釋基因，其中包含2個(gè)與抗性有關(guān)基因(LRR-RLK基因)Cla001017、Cla001019，并通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)這2個(gè)基因在抗性種質(zhì)PI 189225和易感品種K3接種過(guò)程中的表達(dá)量存在顯著差異[51]。Lee等以抗性種質(zhì)PI 189225(C.amarus)為父本、易感種質(zhì)920533(C.lanatus)為母本雜交后獲得178個(gè)F2代群體，通過(guò)苗期噴霧接種進(jìn)行抗性鑒定，依據(jù)葉片發(fā)病、莖部發(fā)病2種鑒定標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行抗性鑒定和連鎖遺傳分析[52]，病原菌為韓國(guó)本土分離的S.cucurbitacearum分離株KACC 40937。結(jié)果表明，西瓜蔓枯病抗性遺傳為數(shù)量性狀，QTL定位分析獲得位于8號(hào)染色體、6號(hào)染色體上的qLL8.1、qSB8.1和qSB6.1的3個(gè)QTL位點(diǎn)。并開(kāi)發(fā)了4套KASP分子標(biāo)記，在9個(gè)野生種質(zhì)及13個(gè)栽培西瓜品種中進(jìn)行驗(yàn)證。位于8號(hào)染色體上的qLL8.1、qSB8.1被鑒定為主要的QTL，解釋了10.0%～10.5%的表型變異(表2)。以西瓜基因組97103 v1為參考基因組，發(fā)現(xiàn)位于8號(hào)染色體的主要QTL(qLL8.1、qSB8.1)在分子chr8_WGRS240 和chr8_WGRS(3)185標(biāo)記之間(0.87 Mb)(表3)包含83個(gè)注釋基因，其中包含4個(gè)與抗性相關(guān)的基因(RLK基因)被鑒定為可能與西瓜抗性相關(guān)的候選基因Cla022133、Cla022184、Cla022195、Cla022196[52]。Gimode等以抗性種質(zhì)PI 482276(C.amarus)為父本、以美國(guó)栽培種Crimson Sweet(C.lanatus)為母本進(jìn)行雜交，獲得178個(gè)F2：3代株系，通過(guò)苗期噴霧接種方式分別進(jìn)行了2次獨(dú)立的接種抗性鑒定試驗(yàn)，病原菌為美國(guó)優(yōu)勢(shì)種S.citrulli分離株12178A。結(jié)果表明，西瓜蔓枯病抗性在F2代中出現(xiàn)正態(tài)分離，表現(xiàn)為數(shù)量性狀[53]。Gimode等經(jīng)表型鑒定與遺傳連鎖分析定位獲得3個(gè)與西瓜蔓枯病抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)(ClGSB3.1、ClGSB5.1和ClGSB7.1)，表型變異解析系數(shù)為6.4%～21.1%(表2)。以西瓜Charleston Gray v1為參考基因組，發(fā)現(xiàn)ClGSB3.1位點(diǎn)區(qū)域中包含65個(gè)注釋基因，ClGSB5.1位點(diǎn)中包含712個(gè)注釋基因，ClGSB7.1位點(diǎn)中包含574個(gè)注釋基因。開(kāi)發(fā)了3套KASP分子標(biāo)記進(jìn)行群體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)位于ClGSB5.1和ClGSB7.1上的標(biāo)記與西瓜蔓枯病抗性存在緊密連鎖(表3)，通過(guò)序列比對(duì)和共線性分析進(jìn)一步鎖定ClGSB7.1位點(diǎn)中的ClCG07G013230和ClGSB5.1位點(diǎn)中的ClCG05G019540(與97103v1版本基因組中Cla020705基因同源)可能為主要的抗性候選基因。Hong等通過(guò)噴霧接種的方式進(jìn)行西蔓枯病抗性定位研究，病原菌為韓國(guó)國(guó)家園藝和草本科學(xué)研究所(NIHH)提供的韓國(guó)本土Didymellabryoniae分離株13-020，以抗性種質(zhì)PI 279461(C.lanatus，致病系數(shù)為24%)為母本、以易感種質(zhì)PI 223764(C.lanatus，致病系數(shù)為85%)為父本進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代表現(xiàn)出抗病(致病系數(shù)為26%)，進(jìn)一步獲得128個(gè)F2代群體單株中85株表現(xiàn)為抗病、43株表現(xiàn)為感病，表明西瓜蔓枯病抗性為多基因控制的數(shù)量遺傳[54]。經(jīng)表型鑒定與遺傳連鎖分析定位獲得3個(gè)與西瓜蔓枯病抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)(ClGSB1.1、ClGSB10.1和ClGSB11.1)，表型變異解析系數(shù)為10.236%～10.237%(表2)。進(jìn)一步在3個(gè)QTL位點(diǎn)開(kāi)發(fā)HRM分子標(biāo)記，共開(kāi)發(fā)出5個(gè)SNPs在ClGSB1.1、ClGSB10.1存在多態(tài)性，最終確定WmGSB1.1-2(Chr01_28 572939)和WmGSB1.1-7(Chr01_28931313)可能與西瓜蔓枯病抗性緊密連鎖(表3)，以西瓜97103 v2為參考基因組，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記WmGSB1.1-2和WmGSB1.1-7間(0.36 Mb)包含40個(gè)注釋基因，其中，包含與抗病相關(guān)基因ClC01G014900、ClC01G015010(RLKs基因)、ClC01G014910、ClC01G014990(WRKY基因)、ClC01G015130被確定為西瓜蔓枯病抗性基因[54]。上述研究采用西瓜抗源材料PI 482276(C.amarus)、PI 189225(C.amarus)、PI 279461(C.lanatus)進(jìn)行西瓜蔓枯病抗性遺傳定位，在西瓜第1、3、5、6、7、8、10、11號(hào)染色體上累計(jì)9個(gè)抗性相關(guān)基因QTL位點(diǎn)(表2)，通過(guò)以SNP開(kāi)發(fā)KASP、HRM分子標(biāo)記在抗感群體中驗(yàn)證，進(jìn)一步篩選出與西瓜1、5、7、8號(hào)染色上5個(gè)主要抗性QTL位點(diǎn)緊密連鎖的9套蔓枯病抗性分子標(biāo)記(表3)，并獲得可能與西瓜蔓枯病抗性相關(guān)基因13個(gè)(表2)，獲得的抗性基因多為RLKs基因，其在西瓜蔓枯病中的抗性作用并未得到驗(yàn)證。在西瓜蔓枯病抗性研究中采用抗源材料、易感材料均不同，并且使用的病原菌菌株來(lái)源不同，試驗(yàn)環(huán)境和季節(jié)均存在不確定性，進(jìn)而導(dǎo)致研究結(jié)果差異較大。綜上，西瓜蔓枯病抗性基因定位研究結(jié)果并不理想，雖有多項(xiàng)相關(guān)研究報(bào)道，但研究結(jié)果差異較大，并未獲得真正可以應(yīng)用于育種的抗性分子標(biāo)記。可能與病原菌株致病力與西瓜蔓枯病抗性間關(guān)系較為復(fù)雜，且受多基因控制有關(guān)。

表3 西瓜蔓枯病抗性連鎖分子標(biāo)記

2.4 其他

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸形成了一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)，抗病性可能受多種因素調(diào)控。但是隨著人們對(duì)抗病基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能的研究，以及對(duì)植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其他組分的進(jìn)一步解讀，有關(guān)植物與病原體互作、抗病基因進(jìn)化的分子機(jī)制研究也不斷深入。盡管基因產(chǎn)物針對(duì)的病原體及致病因子截然不同，但其植物抗性基因的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)特征相對(duì)十分保守。目前，西瓜蔓枯病抗性基因尚不明確，遺傳機(jī)制尚不清晰。Hassan等分別通過(guò)對(duì)西瓜蔓枯病抗性種質(zhì)PI 189225和易感種質(zhì)PI 438676在苗期接種蔓枯病病菌(韓國(guó)本地分離的S.cucurbitacearum，菌株編號(hào)：13-020)后，進(jìn)行西瓜抗性基因(NBS-R基因)表達(dá)譜分析。結(jié)果表明，Cla001821、Cla019863、Cla020705、Cla012430、Cla012433和Cla0124396個(gè)基因在抗性種質(zhì)PI 189225中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于易感種質(zhì)PI 438676，且其中有5個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在接種病菌后12 h達(dá)到峰值，Cla001821在接種后72 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)峰值，Cla020705在接種12、72 h后均出現(xiàn)相對(duì)表達(dá)量峰值[55]。Ren等對(duì)西瓜GDSL基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析，在接種蔓枯病病原菌S.cucurbitacearum(JS002)后，有12個(gè)GDSL基因在抗性種質(zhì)PI 189225和易感品種K3中存在顯著差異表達(dá)，其中基因CLCG02G001050在易感品種K3中的相對(duì)表達(dá)量始終顯著高于在抗性種質(zhì)PI 189225中的相對(duì)表達(dá)量[56]。抗病基因(R-基因)在植物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，以應(yīng)對(duì)各種病原體和昆蟲(chóng)，包括病毒、細(xì)菌、真菌、蚜蟲(chóng)和線蟲(chóng)[57]，NBS類抗病基因作為抗病基因中數(shù)目最多的家族，在植物抵御病蟲(chóng)害中起著關(guān)鍵作用[58]。GDSL脂肪酶是脂肪酶家族中重要的亞家族之一，GDSL脂肪酶廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、油料種子的脂肪酸代謝等過(guò)程[59]。以上研究結(jié)果表明，在西瓜抗性種質(zhì)和易感種質(zhì)接種蔓枯病菌后，R-基因和GDSL脂肪酶基因均存在響應(yīng)機(jī)制，說(shuō)明西瓜抗蔓枯病可能是一個(gè)系統(tǒng)過(guò)程，受到多種代謝途徑調(diào)控。

3 存在問(wèn)題與展望

西瓜栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄[22-24]，蔓枯病病原菌多樣[1]，表現(xiàn)出不同病原菌及分離菌株對(duì)不同抗源的侵染力存在差異，給西瓜抗蔓枯病育種帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雖然近幾年來(lái)育種研究者在病原菌分布調(diào)查、抗性遺傳、基因/QTL定位、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面開(kāi)展了大量工作，也取得了顯著進(jìn)展，但仍有幾個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

首先，西瓜蔓枯病病原菌在世界范圍的分布及變異尚不清楚。當(dāng)前，普遍認(rèn)為西瓜蔓枯病病原菌有3個(gè)近緣種，其形態(tài)相似，可在核酸水平加以區(qū)分[1-2]。目前，美國(guó)[1]、中國(guó)[12，25，28-29]、韓國(guó)[52，54]、土耳其[26]等國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了西瓜蔓枯病病原菌的調(diào)查研究，但其他國(guó)家和地區(qū)有關(guān)西瓜蔓枯病病原菌鑒別情況的報(bào)道較少。我國(guó)對(duì)西瓜蔓枯病病原菌的研究起步較晚，雖然Li等完成了對(duì)華東地區(qū)西瓜蔓枯病病菌的分布調(diào)查[28]，譚蕊完成了西南地區(qū)西瓜蔓枯病病原菌的調(diào)查[25]，認(rèn)為S.cucurbitacearum是我國(guó)華東地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種，在西南地區(qū)無(wú)分布[28]，西南地區(qū)存在S.citrulli、S.carica2種病原菌，未見(jiàn)S.cucurbitacearum，以S.citrulli為優(yōu)勢(shì)種[25]。而徐彥剛2020年通過(guò)田間病株分離鑒定發(fā)現(xiàn)我國(guó)江蘇、浙江、安徽、江西等地西瓜蔓枯病致病菌為S.citrulli[20]。Huang等通過(guò)對(duì)我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)西瓜蔓枯病病原菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，S.citrulli是引發(fā)臺(tái)灣地區(qū)西瓜蔓枯病的主要病原菌[29]。以上結(jié)果表明，我國(guó)西瓜蔓枯病致病菌在不同地區(qū)、不同時(shí)間優(yōu)勢(shì)種存在明顯差異，給西瓜蔓枯病防治帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。同時(shí)，我國(guó)西北、東北地區(qū)西瓜蔓枯病致病菌報(bào)道較少，隨著設(shè)施栽培的發(fā)展，西瓜種植區(qū)不斷擴(kuò)大，以上結(jié)果未必能全面反映我國(guó)西瓜蔓枯病病原菌分布的全貌。2020年，我國(guó)已完成了S.cucurbitacearum基因組測(cè)序工作[30]，但尚未公布S.citrulli、S.carica基因組的信息，病原菌間的遺傳特性和遺傳變異尚不清晰。

其次，西瓜蔓枯病病原菌致病及抗性機(jī)制研究滯后。雖然人們對(duì)西瓜蔓枯病病原菌致病機(jī)制及耐藥性均開(kāi)展了一系列研究，但迄今，關(guān)于蔓枯病病原菌的致病機(jī)制尚不明確。雖然我國(guó)已經(jīng)從南瓜、西瓜中分離獲得蔓枯病病原菌S.cucurbitacearum的分離株zq-1[60]、DBTL4[30]，并完成了相應(yīng)的基因組測(cè)序工作，但兩者之間缺少系統(tǒng)比較研究，其遺傳特性和變異尚不清楚。近2年來(lái)，有多項(xiàng)關(guān)于西瓜蔓枯病抗性基因/QTL定位的相關(guān)報(bào)道，但因使用的抗源材料、易感材料、病原菌菌種及分離株系、試驗(yàn)過(guò)程等不完全一致，使得抗性基因/QTL定位結(jié)果存在很大差異[51-54]，迄今，已在西瓜第1、3、5、6、7、8、10、11號(hào)染色體上累計(jì)定位出9個(gè)抗性相關(guān)基因QTL位點(diǎn)(表2)，針對(duì)不同抗源材料開(kāi)發(fā)出與西瓜1、5、7、8號(hào)染色體上5個(gè)抗性QTL位點(diǎn)高度連鎖的9套西瓜蔓枯抗性分子標(biāo)記(表3)，但這些標(biāo)記并未能在育種中得到實(shí)際應(yīng)用，充分說(shuō)明了西瓜蔓枯病抗性機(jī)制較為復(fù)雜，屬于多基因控制的數(shù)量性狀，尚未明確西瓜蔓枯病植物自身的主要抗性基因，西瓜材料抗蔓枯病機(jī)制研究依然處于空白狀態(tài)。

再次，抗病育種進(jìn)展緩慢。雖然早在1962年人們就開(kāi)始了西瓜抗性材料的篩選[41]，但真正將抗病材料用于育種中并成功得到抗病品種的卻鮮有報(bào)道。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，西瓜蔓枯抗源材料主要來(lái)源于栽培種C.lanatus的近緣種C.amarus[46-49]，而我國(guó)相對(duì)缺乏抗源材料，對(duì)抗性種質(zhì)材料的收集、篩選與鑒定工作有待進(jìn)一步加強(qiáng)。雖然Norton等通過(guò)多年摸索和積累，選育出部分抗蔓枯病西瓜新品種Au-producer、All-sweet scarlet、Au-Jubilant[44-46]，顧衛(wèi)紅等選育出了抗蔓枯病西瓜新品種抗病948等[17]，但這些品種的田間抗性表現(xiàn)不明顯，并且部分品種的商品性狀有待改善，未能得到大面積推廣應(yīng)用。由于在生產(chǎn)上缺少抗病材料，使得病原菌能夠多樣化存在，加上設(shè)施栽培的普及，西瓜蔓枯病迅速蔓延，對(duì)西瓜生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

針對(duì)以上問(wèn)題，國(guó)際研究者應(yīng)加強(qiáng)合作，開(kāi)展全球西瓜主產(chǎn)區(qū)西瓜蔓枯病病原菌調(diào)查研究，充分了解蔓枯病病原菌的分布特征及遺傳多樣性。共享病原菌基因組測(cè)序結(jié)果，研究病原菌之間的遺傳差異，為研究病原菌的毒性、侵染性和對(duì)寄主的選擇性提供新的線索。同時(shí)，加強(qiáng)開(kāi)展西瓜蔓枯病抗性種質(zhì)材料的搜集、鑒定和篩選工作，為抗病育種挖掘重要材料。另外，抗性基因鑒定最關(guān)鍵的點(diǎn)在于表型鑒定的準(zhǔn)確性，西瓜蔓枯病病原菌致病性與寄主抗病性之間的機(jī)制較為復(fù)雜，建立穩(wěn)定的抗性鑒定體系是抗性基因挖掘的基礎(chǔ)之一。針對(duì)已定位獲得的潛在抗性基因，進(jìn)一步開(kāi)展生物功能驗(yàn)證，明確西瓜抗性基因作用機(jī)制，篩選獲得西瓜蔓枯病主效抗性基因，開(kāi)發(fā)西瓜蔓枯病抗性育種核心分子標(biāo)記，所有這些努力都將為西瓜蔓枯病抗性育種提供理論依據(jù)。