轉基因耐除草劑玉米MON87419品系特異性定性PCR檢測方法的建立

李凌燕， 肖 冰， 張旭冬， 陳子言， 王顥潛， 張秀杰， 陳 紅， 梁晉剛

(1.農業農村部科技發展中心，北京 100176； 2.北京農業職業學院，北京 102442；3.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

根據國際農業生物技術應用服務組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)最新統計顯示，在2019年全世界范圍內種植的轉基因玉米占地面積已經達到了6 090萬hm2，約占全世界該植物種植總數的31%[1]，轉基因耐除草劑玉米MON87419由孟山都遠東有限公司研發，將耐受麥草畏基因dmo和耐草銨膦基因pat的表達框共整合至玉米基因組中，通過多代篩選鑒定獲得的耐麥草畏和草銨膦轉基因玉米新品種。自2016年上市以來，該轉化體在美國、澳大利亞、新西蘭等11個國家和地區獲得安全證書批準，并已向我國提出了進口用作加工原料安全證書的申請。目前，尚未發布專門針對該轉基因玉米的檢測方法，為了進行有效監管，制定耐除草劑玉米MON87419的定性PCR檢測方法對開展轉基因檢測和評價非常必要。

目前基于核酸的轉基因檢測技術除傳統PCR檢測以外，生物傳感器技術[2]、等溫擴增技術(LAMP)[3]、數字PCR(digital PCR)[4-8]、RealtimePCR[9-10]、基因芯片技術(gene chip)[11]等新型檢測技術也在不斷的發展，相較于傳統PCR檢測新技術設備專業性更強、技術要求更高。定性PCR方法是一種基于聚合酶鏈式反應的檢測技術，包括待測樣品DNA的提取純化、PCR體系配制、PCR擴增、瓊脂糖電泳4個部分，因其設備普及率高、操作簡便、靈敏度高，是目前應用于轉基因檢測最廣泛的方法之一，也是許多國家用于市場篩查轉基因成分的首選方法[12]。本研究以轉基因耐除草劑玉米MON87419轉化體特異性序列為靶標，以zSSIIb為內標準基因，在5′和3′端設計了一系列PCR定性檢測引物，分別進行引物的篩選、PCR擴增條件和反應體系優化、特異性分析、靈敏度測試、檢出限測試等試驗，建立了轉基因耐除草劑玉米MON87419轉化體特異性定性PCR檢測方法。該方法的建立旨在為該轉化體品系及其衍生產品的鑒定檢測、安全評價和行政監管提供重要的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 轉基因耐除草劑玉米MON87419，由孟山都遠東有限公司研發；非轉基因受體玉米LH244(陰性對照)由孟山都遠東有限公司提供。

特異性測試樣品中，其他轉基因玉米混合樣、轉基因大豆混合樣、轉基因水稻混合樣、轉基因油菜混合樣、轉基因棉花混合樣(表1)，均由筆者所在實驗室收集保存。

表1 轉基因作物混合樣品

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；GoTaq? Green master mix、DL1000 分子量Marker，均購自上海寶生物技術有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.1.3 主要儀器 臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、Q5000超微量紫外分光光度計(美國Quawell公司)、C1000 型梯度PCR儀(美國Bio-rad公司)、Bio-rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 轉基因耐除草劑玉米MON87419及其受體種子單株育苗，隨機各選取10個單株，每個單株選取3張葉片，研磨混勻后，隨機取樣50～100 mg，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA；轉基因玉米混合樣、轉基因大豆混合樣、轉基因油菜混合樣、轉基因水稻混合樣、轉基因棉花混合樣，分別取100 mg粉末樣品，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。用Q5000超微量紫外分光光度計測定DNA的濃度和質量，將DNA濃度統一稀釋至50 ng/μL，備用。

1.2.2 引物的設計與篩選 轉基因耐除草劑玉米MON87419的外源插入位點包含一個dmo基因的表達框和一個pat基因的表達框，不同外源基因片段之間以玉米基因組DNA片段相連接。本研究利用Primer Premier 5軟件，以外源插入T-DNA與基因組連接區域的5′端和3′端轉化體特異性序列為靶標，分別設計轉化體特異性引物(圖1、表2)，進行正交組合。根據中華人民共和國農業部公告-4—2015[13]要求，從中挑選出擴增片段大小在120～300 bp 的引物組合，同時將研發者提供的引物進行試驗(表3)。

表3 定性PCR檢測候選引物組合

以轉基因MON87419基因組DNA為目標基因，配制濃度分別為10%和1%的樣品DNA。以這2個濃度的樣品DNA為模板，對設計引物的適配性進行測試。玉米內標準基因引物參照中華人民共和國農業部1861號公告-3-2012[14]，采用的反應體系和程序與已發布的玉米內標準基因一致。

1.2.3 特異性測試 利用“1.1”節中的基因組DNA為模板，對表3中引物組合的特異性進行測試，同時擴增樣品內標準基因zSSIIb進行質量和純度的質控。

1.2.4 反應條件的優化 設置6個引物濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)和4個退火溫度(54、56、58、60 ℃)，進行正交組合，以濃度為1%的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

1.2.5 靈敏度測試 配制轉基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度分別為10.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%的5個樣品DNA作為模板，按照“1.2.4”節的方法對反應條件進行優化，同時擴增樣品內標準基因zSSIIb進行質量和純度的質控。

1.2.6 檢出限測試 配制轉基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度為0.1%的DNA樣品進行60次PCR測試，每個擴增體系模板用量均為50 ng，同時擴增樣品內標準基因zSSIIb進行質量和純度的質控。

1.2.7 再現性測試 配制轉基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度分別為10.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%的樣品DNA，由2個不同操作人員，在2個不同時間段，利用2臺不同的PCR儀器進行再現性測試，同時擴增樣品內標準基因zSSIIb進行質量和純度的質控。

2 結果與分析

2.1 特異性引物的篩選

瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2)表明，引物組合 5′-2、3′-5和3′-8擴增條帶清晰、無非特異性擴增，無引物二聚體，可作為候選引物進行下一步測試。

2.2 特異性測試

特異性測試結果(圖3、圖4)表明，引物組合 3′-5 條帶清晰、無非特異性擴增。將該引物組合PCR擴增產物進行測序，測序結果與研發者提供的序列比對完全一致，表明該引物特異性良好，將其命名為MON87419-F/MON87419-R。

2.3 反應條件的優化

由圖5可知，引物濃度為0.6、0.8 μmol/L的擴增效率和條帶亮度基本一致，退火溫度為58 ℃和60 ℃時該引物的特異性更好、無非特異擴增及引物二聚體。為了與內標的退火溫度保持一致， 并綜合考慮引物的特異性和擴增效率，確定定性PCR方法的引物終濃度為0.6 μmol/L，退火溫度為58 ℃。

2.4 靈敏度測試

由圖6、圖7可知，在所有濃度模板DNA樣品中均獲得穩定的擴增片段，確定該方法的靈敏度為0.05%。

2.5 檢出限測試

由圖8、圖9可知，60個樣品均穩定擴增出預期大小一致的條帶，確定該方法的檢出限為0.1%。

2.6 再現性測試

由圖10、圖11可知，全部測試樣品在2次試驗中均穩定擴增出與預期大小一致的條帶，說明本方法具有良好的再現性。

3 討論與結論

近年來文獻中報道了很多針對轉化體的檢測技術及方法，比如基因芯片法、傳感器法、恒溫擴增法、數字PCR技術等，但PCR檢測方法因具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、重現性好的特點，應用最為廣泛[15-16]。不僅是國內轉化體檢測中最為常用和普遍的方法，也是國際上轉基因產品檢測方法中的金標準[17-19]。根據靶標DNA片段的特異性差異，PCR檢測可分為通用元件的篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測和品系特異性 PCR檢測4類。品系特異性PCR的檢測目標是植物基因組與外源插入載體的連接區，連接區序列具有特異性，且是單拷貝的，所以品系特異性PCR檢測方法具有非常高的準確性和特異性，是目前國內、國際上轉基因產品檢測方法標準的首選[20]。

本研究以轉基因耐除草劑玉米MON87419轉化體特異性序列為靶標，分析基因序列信息后設計引物，經體系優化、特異性測試、靈敏度測試、再現性測試，建立轉基因玉米MON87419的定性PCR檢測方法。結果表明，本方法能夠精準檢測出轉基因玉米MON87419樣品，轉化體特異性片段大小是 216 bp，方法檢測靈敏度可達0.05%，檢出限達到0.1%，具有良好的品系特異性和靈敏度。本方法的主要技術參數全部符合農業農村部相關轉基因分子檢測標準的要求，可為該品系及其衍生品種的安全評價、有效監管及知識產權保護提供有效的技術支撐。

隨著轉基因檢測技術的不斷進步和發展，定量檢測方法的建立也成為必然趨勢。龍麗坤等建立了轉基因玉米CM8101的實時熒光PCR檢測方法[21]，劉雙等建立了轉基因大豆ZH10-6的實時熒光PCR檢測方法[22]。楊晨等用微滴數字PCR技術和實時熒光PCR技術對大豆中轉基因成分進行檢測[23]。基于這些檢測方法的不斷發展和完善，筆者所在研究團隊將繼續研發基于實時熒光和數字PCR等新技術的定量檢測方法，以期為我國轉基因作物的檢測和科學監管提供更有力的技術支撐。