耐低溫糖化馬鈴薯資源篩選與評價

尹 旺， 鄧仁菊， 陳明俊， 羅小波， 雷尊國， 李 飛

(貴州省農業科學院生物技術研究所，貴州貴陽 550006)

低溫糖化是馬鈴薯塊莖在低溫條件下的自我保護機制，是一個復雜的生理生化過程，涉及塊莖低溫貯藏期間的淀粉降解與合成、蔗糖降解與合成、呼吸代謝等[1]。有關馬鈴薯低溫糖化相關調控機制研究已成為馬鈴薯油炸加工型新品種培育的一個重要領域[2]。目前，馬鈴薯油炸加工型品種大西洋、snodon的區域適應能力在逐步下降，栽培難度逐年增加，油炸加工型馬鈴薯新品種選育已成為我國當前馬鈴薯新品種培育的短板[3]，其難點關鍵在于耐低溫糖化材料的創制和利用。因此，馬鈴薯耐低溫糖化能力鑒定和評價對油炸加工專用型馬鈴薯新品培育及產業發展具有重要意義。馬鈴薯塊莖中還原糖含量直接決定油炸品質[4-5]。低溫條件下，馬鈴薯塊莖中還原糖含量升高的現象稱為馬鈴薯低溫糖化，而酸性轉化酶活性與馬鈴薯塊莖低溫糖化直接相關，抑制酸性轉化酶活性可以降低低溫貯藏下馬鈴薯塊莖的還原糖含量，改善油炸加工色澤[6-15]。當前馬鈴薯中鑒定出了StInvInh2A、StInvInh2B2個PMEI類抑制子基因，能夠對馬鈴薯酸性轉化酶活性起到特異性抑制作用，利用轉基因技術超量或干涉其表達，能有效調控馬鈴薯低溫貯藏下的酸性轉化酶活力，從而調控馬鈴薯抗低溫糖化能力[16-18]。本研究前期研究測定馬鈴薯低溫糖化相關基因StInvInh2、StvacINV的相對表達量、低溫糖化生理生化指標的還原糖含量、蔗糖含量、酸性轉化酶活性以及炸片色澤亨特系數a*、b*、L*，綜合評價47份馬鈴薯材料的耐低溫糖化能力。從而鑒選出耐低溫糖化馬鈴薯資源，為油炸加工專用型馬鈴薯新品種培育擴大資源基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的47份馬鈴薯材料由貴州省生物技術研究所提供，詳見表1。

表1 47份馬鈴薯材料名稱

1.2 試驗設計

于2020年10月收獲種植于貴州省畢節市威寧彝族回族苗族自治縣的47份馬鈴薯資源材料。將47份材料各取健康薯塊5個，室溫放置7 d，使表面充分木栓化。然后置于貴州省貴陽市農業科技創新大樓冰箱，4 ℃貯藏30 d后，再取出材料。將每個薯塊對半切開，一半用于生理生化指標測定，一半用于分子指標測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬鈴薯塊莖品質測定 可溶性糖含量及酸性轉化酶活性參考張遲的方法[10]測定，還原糖含量采用二硝基水楊酸法測定，蔗糖含量采用國家衛生部測定標準(GB5009)測定。

1.3.2 馬鈴薯炸片色澤鑒定 利用立式炸片鍋進行炸片，具體步驟如下：(1)馬鈴薯塊莖去皮，小型切片器切取厚2 mm左右薯片，置于清水中2 min；(2)取出切好的薯片，吸水紙吸干表面水分，做3個技術重復；(3)170 ℃油炸3 min至完全無水泡冒出；(4)拍照。炸片色澤采用Hunter Lab D25NC標準色差儀測定，在D65光源，距離100 mm，測定亨特系數(L*、a*、b*)。

1.3.3 基因相對表達量測定

1.3.3.1 馬鈴薯塊莖總RNA提取 采用天根(DP441)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒。DP441試劑盒組成見表2。

1.3.3.2 RNA反轉錄試驗 參照TOYOBO反轉錄試劑盒(Code No.FSQ-101)進行，步驟如下：(1)RNA變性：將RNA樣品65 ℃水浴5 min，立即置于冰上冷卻(提高易于形成高級結構的RNA的反轉錄效率)。(2)參照表3進行反應體系配制。(3)參照表4進行反轉錄反應(PCR儀)。反應完成后，置于-20 ℃或4 ℃保存，在進行real time qPCR反應時應適當稀釋。

表2 DP441試劑盒組成

表3 反應體系

表4 反轉錄反應體系

1.3.3.3 Real time qPCR試驗 參照vazyme RT-qPCR試劑盒(AceQ?qPCR SYBR? Green Master Mix)進行操作，步驟如下：(1)參照表5進行RT-qPCR反應體系配制。(2)RT-qPCR反應程序。本試驗采用兩步法程序反應，RT-qPCR儀(博樂 CFX96TMOptics Module，785BR06729)，程序見表6。(3)采用博樂對應軟件Bio-Rad CFX 3.1/BioRadCFXManager進行分析。

表5 RT-qPCR反應體系

表6 RT-qPCR反應程序

1.3.3.4 引物序列 本研究采用的引物名稱及引物序列見表7。

表7 引物名稱及引物序列

2 結果與分析

2.1 低溫貯藏后相關品質、相關基因表達量及炸片色澤亨特系數的變異分析

由表8可知，4 ℃貯藏30 d后，不同馬鈴薯材料低溫糖化相關基因(StvacINV、StInvInh2)的相對表達量、低溫糖化生理生化指標、炸片色澤亨特系數的變異系數差異較大，其大小順序依次為StInvInh2相對表達量>還原糖含量>a*>酸性轉化酶活性>蔗糖含量>StvacINV相對表達量>L*>b*，其中StInvInh2相對表達量變異系數達到80.74%，還原糖含量變異系數達到79.34%，a*變異系數達到70.50%，酸性轉化酶活性變異系數達69.33%。

表8 馬鈴薯相關品質、相關基因表達量及炸片色澤亨特系數的變異分析

2.2 低溫貯藏后馬鈴薯品質、相關基因表達量及油炸色澤亨特系數間的相關性分析

從表9中可以看出，4 ℃貯藏30 d后，8個指標間，6對指標呈極顯著正相關，9對指標呈極顯著負相關，其中還原糖含量與酸性轉化酶活性、亨特系數a*間呈極顯著正相關，相關系數分別為0.967、0.701；與StInvInh2相對表達量、亨特系數L*、b*間呈極顯著負相關，相關系數分別為 -0.771、-0.754、-0.513。蔗糖含量與StInvInh2相對表達量呈極顯著正相關，相關系數為0.399；與亨特系數a*呈極顯著負相關，相關系數為 -0.405。酸性轉化酶活性與亨特系數a*間呈極顯著正相關，相關系數為0.652；與StInvInh2相對表達量、亨特系數L*、b*呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.781、-0.710、-0.503。StvacINV相對表達量與其他指標間不存在顯著相關性；StInvInh2相對表達量與亨特系數L*呈極顯著正相關，相關系數為0.664；與亨特系數a*呈極顯著負相關，相關系數為-0.654。亨特系數L*與b*呈極顯著正相關，相關系數為0.553，與a*呈極顯著負相關，相關系數為-0.864。

表9 馬鈴薯品質、相關基因表達量及油炸色澤亨特系數間的相關性分析

2.3 低溫貯藏后馬鈴薯品質、相關基因表達量及油炸色澤亨特系數主成分分析

表10顯示，前5個主要成分累計貢獻率達96.142%，表明前5個主要成分涵括了不同馬鈴薯資源低溫貯藏后的主要差異指標信息。其中，第1成分特征值為4.407，貢獻率為55.093%；第2成分特征值為1.338，貢獻率為16.729%，累計貢獻率為71.822%；第3成分特征值為0.821，貢獻率為10.268%，累計貢獻率為82.090%；第4成分特征值為0.605，貢獻率為7.563%，累計貢獻率為89.653%。對前5個成分特征向量(表11)分析可知，第1成分中還原糖含量特征向量絕對值最大，為0.938，表明還原糖含量對第1成分影響最大，故篩選還原糖含量因子作為第1成分；第2成分中StvacINV相對表達量特征向量絕對值最大，為0.710，故篩選StvacINV相對表達量因子作為第2成分；第3成分中，因StvacINV相對表達量已作為第2成分，故篩選亨特系數b*因子作為第3成分，特征向量為-0.510；依次類推，第4成分和第5成分分別為蔗糖含量因子和亨特系數a*因子，特征向量分別為0.551、-0.416。

表10 馬鈴薯主要性狀的主成分分析

表11 前5個主成分對應的特征向量

2.4 種質資源聚類分析

采用平方歐式距離組內鄰接法對47份馬鈴薯資源4 ℃貯藏30 d后的還原糖含量、蔗糖含量、酸性轉化酶活性、StvacINV相對表達量、StInvInh2相對表達量及亨特系數L*、a*、b*進行系統聚類分析。結果顯示：當平均歐式距離D=8時，將47份馬鈴薯資源分成5類(圖1)。第Ⅰ類18個資源(含炸片加工專用型品種大西洋、snodon)，該類還原糖含量為(3.1±1.0) mg/g，變幅1.38～5.46 mg/g；蔗糖含量為(2.19±0.76) mg/g，變幅1.35～3.35 mg/g；酸性轉化酶活性為(10.67±2.95) μgRS/(min·g)，變幅6.99～18.23 μgRS/(min·g)；StvacINV相對表達量為2.19±0.42，變幅1.4～2.9；StInvInh2相對表達量為3.87±1.50，變幅1.1～7.5；亨特系數L*為46.8±3.85，變幅36.33～52.55，亨特系數a*為7.49±2.08，變幅2.41～11.44，亨特系數b*為26.47±1.83，變幅21.60～29.08。第Ⅱ類16個資源，該類還原糖含量為(1.27±0.59) mg/g，變幅0.67～2.28 mg/g，蔗糖含量為(2.75±0.54) mg/g，變幅1.48～3.45 mg/g；酸性轉化酶活性為(6.30±2.21) μgRS/(min·g)，變幅3.85～10.33 μgRS/(min·g)；StvacINV相對表達量為2.08±0.46，變幅 1.3～3.2；StInvInh2相對表達量為8.87±3.25，變幅 3.6～13.4；亨特系數L*為54.11±3.31，變幅45.67～58.39，亨特系數a*為3.26±2.41，變幅0.39～8.89，亨特系數b*為25.22±2.11，變幅22.22～28.48。第Ⅲ類3個資源，該類還原糖含量為(10.04±1.12) mg/g，變幅9.34～11.34 mg/g，蔗糖含量為(2.45±0.49) mg/g，變幅2.16～3.02 mg/g；酸性轉化酶活性為(34.69±0.79) μgRS/(min·g)，變幅33.79～35.22 μgRS/(min·g)；StvacINV相對表達量為1.77±0.15，變幅 1.6～1.9；StInvInh2相對表達量為0.37±0.12，變幅0.3～0.5；亨特系數L*為44.27±3.68，變幅40.76～48.10，亨特系數a*為10.16±1.86，變幅8.04～11.50，亨特系數b*為25.16±3.17，變幅21.52～27.29。第Ⅳ類6個資源，該類還原糖含量為(6.48±0.86) mg/g，變幅5.73～7.99 mg/g，蔗糖含量為(1.64±0.25) mg/g，變幅1.37～1.99 mg/g；酸性轉化酶活性為(20.78±2.27) μgRS/(min·g)，變幅17.44～23.82 μgRS/(min·g)；StvacINV相對表達量為2.35±0.26，變幅2.1～2.8，StInvInh2相對表達量為1.32±0.38，變幅0.9～1.9；亨特系數L*為39.34±3.88，變幅34.59～44.91，亨特系數a*為11.45±0.57，變幅10.57～12.24，亨特系數b*為23.66±2.72，變幅19.92～26.76。第Ⅴ類4個資源，該類還原糖含量為(9.61±1.57) mg/g，變幅7.88～11.56 mg/g；蔗糖含量為(2.40±0.74) mg/g，變幅 1.68～3.26 mg/g；酸性轉化酶活性為(31.22±3.84) μgRS/(min·g)，變幅28.45～36.87 μgRS/(min·g)；StvacINV相對表達量為2.23±0.15，變幅2.1～2.4，StInvInh2相對表達量為0.70±0.22，變幅0.4～0.9；亨特系數L*為33.07±2.09，變幅30.47～35.14，亨特系數a*為11.51±1.28，變幅9.67～12.46，亨特系數b*為18.44±2.89，變幅15.25～21.98。

3 討論與結論

已有研究表明：馬鈴薯酸性轉化酶直接參與塊莖低溫糖化過程[10-14]，故酸性轉化酶活性相關調節基因表達均可影響馬鈴薯耐低溫糖化能力，前期研究發現煙草酸性轉化酶抑制子基因VIH[19]和馬鈴薯酸性轉化酶抑制子基因StInvInh2[18]均可調節馬鈴薯塊莖還原糖含量。本研究發現馬鈴薯低溫貯藏后，StInvInh2相對表達量與酸性轉化酶活性、還原糖含量均呈極顯著負相關，表明馬鈴薯酸性轉化酶抑制子基因可能通過抑制酸性轉化酶活性， 從而影響塊莖蔗糖代謝，從而降低塊莖中還原糖含量。同時，塊莖中的還原糖含量、酸性轉化酶活性與炸片色澤亨特系數L*、a*、b*均存在極顯著相關性，StInvInh2相對表達量與炸片色澤亨特系數L*、a*均存在極顯著相關性，而StvacINV相對表達量與炸片色澤亨特系數L*、a*、b*相關性不顯著，表明在低溫貯藏中，還原糖含量、酸性轉化酶活性、StInvInh2相對表達量是馬鈴薯油炸加工色澤變化的主要內在因素，馬鈴薯低溫糖化的關鍵在于酸性轉化酶活性和其抑制子基因StInvInh2的相對表達量，而酸性轉化酶基因StvacINV的相對表達量在馬鈴薯低溫糖化過程中影響較小。

表12 5個類群的類平均標準差及變幅

目前，我國馬鈴薯油炸加工專用型新品種選育工作進展緩慢。油炸加工專用型馬鈴薯品種單一且自育品種少[3，20]，本研究發現馬鈴薯低溫貯藏后遺傳多樣性豐富，其中以還原糖含量、酸性轉化酶活性、StInvInh2相對表達量、亨特系數a*4個指標變異系數較大，含豐富的遺傳信息，而主成分分析結果中前5個特征向量分別為還原糖含量、StvacINV相對表達量、亨特系數b*、蔗糖含量、亨特系數a*，可作為馬鈴薯資源低溫貯藏后差異分析的主要因子。另外，對47份資源的聚類分析結果表明，第Ⅱ類共16份馬鈴薯資源的耐低溫糖化能力明顯優于其他4類，包括優于目前油炸加工專用型馬鈴薯品種大西洋、snodon，因此可作為下一步油炸加工型馬鈴薯品種的更新和品種儲備。