鐵皮石斛DobHLH96基因克隆及表達分析

張紅瑞， 理 雅，， 于白音，， 劉博婷， 陳 潔， 劉羽佳

[1.河南農業大學農學院，河南鄭州 450046； 2.韶關學院英東生物與農業學院，廣東韶關 512005；3.廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室(韶關學院)，廣東韶關 512005]

植物在應對生物、非生物脅迫的過程中逐漸進化形成了由轉錄因子參與調控的極為復雜而高效的分子應答機制[1]，轉錄因子是植物參與脅迫應答過程中具有重要調控作用的DNA結合蛋白，被激活后能夠調控下游相關基因或其他轉錄因子表達，從而提高植物的抗逆能力[2]。bHLH轉錄因子(transcription factors，TFs)是植物中僅次于MYB TFs的第二大轉錄因子基因家族，由約60個氨基酸組成2個高度保守的結構域，N端的堿性區域能與順式作用元件E-box(5′-CANNTC-3′)結合；螺旋區域通過2個α-螺旋的相互作用，形成同源/異源二聚體，從而與靶基因啟動子的相關部位結合，調控下游基因表達[3]。已有研究發現，植物中的bHLH TFs參與植株的生長發育、逆境脅迫、調節信號轉導與合成代謝等多種重要的生理代謝過程[4]。例如，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中異源過表達卷柏(Selaginellatamariscina)SlbHLHopt基因能夠顯著提高植株在缺水脅迫、鹽脅迫下的種子萌發率、綠色子葉出苗率[5]；擬南芥中2個bHLH TFs(AtLP1和AtLP2)可以調控植株葉片的長寬率及表皮毛形態[6]；另有研究表明，擬南芥bHLH TFs能與藍光受體隱花色素互作來調控開花時間，抑制AtbHLH113基因的表達，從而推遲植株開花、提高花青素含量[7-8]；丹參(Salviamiltiorrhiza)中的SmbHLH92基因能夠負調控植株毛狀根中有關酚酸、丹參酮生物合成關鍵酶的基因轉錄水平[9]。由此可見，bHLH TFs在植株生長發育和次生代謝物質的合成過程中具有重要作用。另外，bHLH TFs能夠參與植物響應非生物脅迫、病蟲害等逆境脅迫過程，如百脈根(Lotusjaponicus)同源過表達LjbHLH7基因能夠提高植株的抗蟲性[10]；同源過表達GmbHLH3基因的大豆(Glycinemax)毛狀根復合植株和異源轉基因擬南芥對Cl-/鹽脅迫的耐受性增強[11]；在擬南芥中異源過表達葡萄(Vitisvinifera)VvbHLH1基因能夠增強轉基因擬南芥的耐旱、耐鹽能力[12]；異源過表達甜菜(Betavulgaris)BvbHLH93基因的擬南芥能夠通過增強抗氧化酶活性、減少活性氧(ROS)的產生來提高轉基因植株對鹽脅迫的耐受性[13]；異源過表達蘋果(Maluspumila)MdbHLH130基因能夠提高轉基因擬南芥的發芽率和存活率，增強其抗氧化性，緩解脫落酸(ABA)誘導的氣孔關閉及葉片失水[14]；過表達水稻(Oryzasativa)bHLH TF(OsPTF1)能提高缺磷條件下同源轉基因植株的瞬時磷吸收速率[15]。另有研究發現，水稻中的OsbHLH6基因能夠通過調節水楊酸、茉莉酸的信號轉導來調節植株在感染稻瘟病時的防御機制[16]；小麥(Triticumaestivum)過表達TabHLH49基因后能夠提高植株的耐旱性[17]；煙草(Nicotianatabacum)NtbHLH123基因能夠調控下游NtCBF基因表達，其過表達能夠增強轉基因煙草中的抗氧化酶活性，從而調控植株的耐寒能力[18]。由此可見，bHLH TFs對植物適應和抵御不同逆境脅迫具有重要調控作用。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生草本藥用植物，其干燥莖被《中華人民共和國藥典》歷版單獨收載，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，是我國傳統名貴中藥材，被譽為“中華九大仙草之首”，主要分布于我國安徽、浙江、福建等地。現代藥理學研究發現，鐵皮石斛中有多糖、生物堿、氨基酸等多種有效成分，具有增強免疫力、抗疲勞、抗氧化、降血壓、保護肝臟等作用[19]。在自然條件下，野生鐵皮石斛繁育率較低，加上近年來生存環境惡化、人為過度采挖等因素的影響，導致野生鐵皮石斛種質資源遭到嚴重破壞，已瀕臨滅絕[20]。近些年來，隨著組織培養、集成栽培技術的發展，人們已經完成從野生獲取鐵皮石斛到栽培鐵皮石斛的轉變，但目前還存在栽培品種混雜、成品質量良莠不齊等問題[21]。因此，深入研究鐵皮石斛bHLH轉錄因子響應逆境脅迫的分子遺傳機制，對于進一步通過遺傳改良方法提高鐵皮石斛藥用有效成分含量及培育高產、優質、抗逆的藥用鐵皮石斛優良品種具有重要意義。本研究旨在通過篩選鐵皮石斛轉錄組數據，克隆獲得DobHLH96cDNA全長序列，并對其理化性質、蛋白結構、進化關系等進行預測分析，對其組織表達特性及其在低溫、干旱脅迫和ABA處理下的表達模式進行初步分析，以期為進一步挖掘DobHLH96基因的生物學功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

本研究所用試驗材料為廣東丹霞鐵皮石斛，由韶關市石斛工程技術開發中心提供。將鐵皮石斛蒴果進行消毒處理后，播種于生根培養基中，無菌培養約6個月后，選取生長狀況一致的幼苗進行后續試驗。以正常生長的植株為對照，將低溫處理組置于4 ℃恒溫、恒濕培養箱中；模擬干旱處理組用20%聚乙二醇(PEG)-6000進行澆灌，對照組澆灌水；ABA處理組用100 μmol/L ABA澆灌，對照組澆灌水；3個處理組均在處理0、1、3、6、9、12、24 h分別進行取樣，用液氮處理1 min后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。每個樣品設3次生物學重復。

1.2 基因克隆

以鐵皮石斛葉片RNA為模板，利用反轉錄試劑盒[購自寶生物工程(大連)有限公司，RR036A]合成cDNA。根據美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中的云南鐵皮石斛同源序列(序列號：LOC110116474)設計引物(F：5′-A T G T C A T T C G A A A T G C T T T C T T-3′；R：5′-T T A G A A C G A C A G G G G C G G G T T-3′)，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用25.0 μL PCR擴增體系：12.5 μL 2×Master Mix(購自北京蘭博利德生物技術有限公司，T0201)，各1.0 μL上、下游引物，2.0 μL cDNA，用ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 7 min。將擴增產物連接至植物表達載體pROKⅡ中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞并選取陽性單克隆進行測序。

1.3 生物信息學分析

在NCBI數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中使用Blast P檢索其他物種與鐵皮石斛DobHLH96蛋白的同源序列；用DNAMAN、MEGA 11鄰接法對這些序列進行多序列比對和系統進化樹的構建；蛋白結構域、理化性質分別用Pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)、ExPASy ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進行預測；二級結構、親疏水性用SPLIT 4.0 SERVER(http：//split.pmfst.hr/split/4/)進行分析；三級結構用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)進行構建；通過New PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace)對DobHLH96啟動子的順式作用元件進行預測分析。

1.4 基因表達分析

將上述樣品抽提RNA后送至深圳華大基因科技有限公司構建RNA文庫并測序(Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM)。移除接頭和低質量的原始數據(raw reads)，用Tophat 2.0將高質量可用數據(clean reads)與鐵皮石斛基因組參考序列進行比對，用Cufflinks進行組裝，獲得轉錄組數據，基因表達量以FPKM(fragments per kilobase million)表示，對鐵皮石斛DobHLH96基因在低溫、干旱和ABA脅迫處理下的表達模式進行分析。用SPSS 24.0軟件對數據進行處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛DobHLH96的克隆與序列分析

以鐵皮石斛葉片cDNA為模板，利用引物進行特異性擴增，電泳結果顯示，特異性條帶的長度在 1 000 bp 左右，測序獲得鐵皮石斛DobHLH96完整的開放閱讀框全長序列為960 bp(圖1-A)，編碼319個氨基酸殘基(圖2)。與參考序列(序列號：LOC110116474)進行對比發現有6個堿基差異，其中1個非同義替換，5個同義替換。基因結構和染色體定位分析結果顯示，DobHLH96基因位于染色體骨架NW_021318852.1區域， 含有2個內含子、3個外顯子(圖1-B)。

2.2 鐵皮石斛DobHLH96蛋白理化性質分析

ExPASy ProtParam分析結果顯示，DobHLH96蛋白的分子式為C1 357H2 174N398O417S14，分子量為31.2 ku，理論等電點為6.51，不穩定性指數為82.59，是不穩定蛋白。用SPLIT 4.0 SERVER在線軟件對其親疏水性、蛋白二級結構進行預測，推測其為親水性蛋白(圖3-A)，其二級結構由22.26% α-螺旋、9.09% β-折疊構象延伸鏈和68.65%無規則卷曲組成(圖3-B)。用SWISS-MODEL構建的DobHLH96蛋白的三級結構如圖3-C所示，可見DobHLH96蛋白與植物轉錄因子MYC2的相似度為31.25%。在Pfam上分析鐵皮石斛DobHLH96蛋白的保守結構域，結果顯示，DobHLH96蛋白具有HLH結構域(圖4)，屬于bHLH TFs家族特有的基因結構域，表明本研究克隆獲得的基因為DobHLH96。

2.3 DobHLH96蛋白的同源性和系統發育關系分析

在NCBI上利用Blast P對鐵皮石斛的bHLH96氨基酸序列進行同源序列分析，選擇不同物種同源性較高的序列進行比對發現，與其同源性最高的是鼓槌石斛(KAH0457194)，相似度為96.5%，其次是建蘭(QDL88322.1)，相似度為84.95%，與小蘭嶼蝴蝶蘭(XP_020572213.1)的相似度為83.39%，此外與海棗(XP_026662269.2)的相似度也較高。多重序列對比結果顯示，DobHLH96蛋白序列與其他植株的bHLH蛋白序列均在88～139的位置含有HLH結構域(圖5)。用MAGA 11.0構建進化樹，發現鐵皮石斛DobHLH96蛋白與鼓槌石斛bHLH蛋白聚在同一分支(圖6)，表明其親緣關系最近。

2.4 DobHLH96的表達模式分析

為了研究DobHLH96在鐵皮石斛不同組織中的表達情況，從NCBI中下載8個鐵皮石斛組織(花柱、花蕾、葉、唇瓣、灰白根、綠根尖、萼片和莖)的差異表達數據[22]。結果顯示，DobHLH96在鐵皮石斛的不同部位均有表達，但是其相對表達量存在顯著差異，相對表達量排序為花蕾>花柱>萼片>葉>灰白根>唇瓣>莖>綠根尖(圖7)。

2.5 DobHLH96在不同脅迫下的表達分析

bHLH轉錄因子可響應多種非生物脅迫，從而提高植株的抗逆性。啟動子元件分析結果顯示，DobHLH96基因啟動子序列中含有低溫響應、干旱響應、水分脅迫響應以及ABA響應等元件(表1)。因此， 對DobHLH96基因在低溫、干旱和ABA處理下的表達表達模式進行分析，結果表明，隨著時間的增加，DobHLH96的相對表達量在低溫處理下呈先下降后上升而后再下降的趨勢，在處理后6 h達到最高值(圖8-A)。在ABA處理下，DobHLH96相對表達量的變化趨勢與低溫處理的變化趨勢基本一致，同樣是先下降后上升再下降，且相對表達量在處理后6 h最高(圖8-B)，表明DobHLH96相對表達量在ABA處理、冷脅迫處理下具有相同的表達模式；在干旱處理下，DobHLH96相對表達量的變化趨勢與ABA處理類似，其表達水平在處理后9 h最高(圖8-C)。

表1 DobHLH96基因啟動子元件分析

3 討論

bHLH TFs廣泛存在于動植物中，其蛋白結構最早于1989年在小鼠的肌肉中被發現并得到鑒定[23]，目前已在多種植物中被發現并得到鑒定，其蛋白功能特性大多數是通過在模式植物擬南芥中研究發現的[4]。前人研究發現，真核生物中的bHLH家族成員分為六大類(A、B、C、D、E、F)，6組成員能與不同堿基序列特異性結合，例如A組能與E-Box核心序列特異性結合，E組優先結合CACGNG序列，它們在生物體內發揮不同的生物學功能，其中D組缺少1個典型的堿性區域，被稱為非典型的bHLH蛋白，主要與其他bHLH蛋白形成同源二聚體，從而抑制其轉錄活性[24]。本研究克隆得到的DobHLH96的開放閱讀框全長序列為 960 bp，編碼319個氨基酸殘基，但是預測保守結構域時發現，該蛋白僅有1個HLH結構域，缺少堿性區域，屬于D組的非典型bHLH蛋白。

bHLH TFs在植物不同組織器官中的表達水平存在顯著差異，具有不同的功能。管麗婷研究發現，火龍果(Hylocereusundatus)HubHLH2基因主要在根中表達，而在莖、果實中的表達量較低[25]；甘藍型油菜(Brassicanapus)BnbHLH122-1在各組織器官中均有表達，從苗期到花期，在根、葉中的表達量升高，但在莖中的相對表達量始終較低[26]；煙草NtbHLH112在葉中的相對表達量較高，尤其是在衰老葉片中的相對表達量最高，在根、花蕾中的相對表達量較低[27]。本研究發現，DobHLH96在花器官中的相對表達量最高，而在其他組織中的相對表達量較低，暗示該基因在調控鐵皮石斛花器官的分化、生殖發育過程中發揮了重要作用。另外，順式作用元件分析結果顯示，DobHLH96啟動子序列中含有與花粉及其他組織特異表達相關的元件，因此推測DobHLH96基因編碼非典型的bHLH蛋白可能與其他bHLH蛋白互作，在鐵皮石斛開花和生殖發育過程中起著重要的調控作用。

bHLH TFs在植物應對非生物脅迫的應答過程中具有重要的調控作用，其參與調控逆境的信號通路可以分為3種：獨立于ABA的信號通路、依賴于ABA的信號通路以及2種信號通路相互重疊[4]。以往的研究表明，ICE1-CBF-COR是植物抵御低溫脅迫的主要信號轉導途徑[28]，如在檸檬(Citrus×limon)中異源過表達枳(Poncirustrifoliata)PtrICE1基因能夠提高轉基因植株中的抗氧化酶活性，減少活性氧的積累，進而提高植株對低溫的耐受性[29]；在煙草中過表達枳PtrbHLH基因能夠顯著增強植株內的POD活性，提高轉基因植株在低溫條件下的耐寒性[30]。本研究發現，鐵皮石斛DobHLH96基因在低溫和ABA處理下的表達模式一致，暗示DobHLH96基因可能是通過依賴于ABA的信號通路響應低溫脅迫。值得一提的是，本研究還在DobHLH96啟動子序列中發現了MYCCONSENSUSAT(CANNTG)元件，該元件為ICE1-CBF-COR調控網絡中ICE1能夠識別并結合的1個關鍵序列[31]。因此，推測DobHLH96基因可能在有ABA存在時通過ABA信號途徑調控下游基因的表達，從而參與鐵皮石斛低溫脅迫應答過程。在沒有ABA存在時，DobHLH96可能通過ICE1-CBF-COR低溫信號途徑抵御低溫脅迫，但具體響應機制尚未可知。此外，前人研究發現，bHLH TFs在干旱脅迫應答時主要通過調節ABA的敏感性、氣孔開閉、葉毛狀體和根毛的發育來增強植株對干旱的耐受性[32]。例如在擬南芥中過表達蘋果(Maluspumila)bHLH轉錄因子MdCIB1基因能通過提高脯氨酸含量、降低過氧化物積累及增強抗氧化酶活性來增強轉基因植株的耐旱能力[33]；苦蕎(Fagopyrumtataricum)FtbHLH3基因在擬南芥中異源過表達，轉基因植株能通過ABA依賴的信號途徑正向調節干旱/氧化脅迫耐受性[34]；在水分脅迫下，外源ABA處理可提高甘蔗(Saccharumofficinarum)內源ABA含量，增強抗氧化酶活性[35]。上述研究均證實，ABA能通過感知和傳遞逆境信號，提高ABA的信號轉導能力，進一步調控植株的抗逆性。本研究發現，DobHLH96基因的表達明顯受到低溫、干旱和ABA處理的誘導，并且在3種處理下，DobHLH96的表達水平整體呈現相似的變化趨勢。另外，DobHLH96基因啟動子序列含有與非生物脅迫、ABA、低溫及脫水響應相關的順式作用元件，提示DobHLH96基因可能通過ABA介導的信號途徑來響應低溫、干旱脅迫，但具體分子調控機制暫不明確。因此，今后應深入挖掘DobHLH96基因響應干旱和低溫脅迫的分子調控機制，為鐵皮石斛的遺傳改良提供進一步的理論基礎。