SNHG12在乙肝病毒X蛋白誘導肝癌發生中的作用研究

吳 勇 況 欽 周夢瑤 杜 彬 毋 楠 馮 濤

重慶醫科大學生物化學與分子藥理重點實驗室(重慶 400016 )

在原發性肝癌中，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的一種類型，也是全球癌癥死亡的主要之一[1]。全球大約有3.5億的人感染慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，占全球至少50%的HCC病例[2]。而乙肝病毒X蛋白(HBV X protein，HBx)是HBV的核心功能蛋白,它能夠通過蛋白和蛋白之間的相互作用,引起病毒的復制，從而更改宿主基因表達[3]。以至于促進腫瘤細胞的增殖、細胞的凋亡、遷移侵襲，以及導致代謝重組，從而導致肝癌的發生,促使HCC發展[4]。

大量的研究表明，長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)在HCC發生中有著極其重要的作用[5]。lncRNA缺乏編碼蛋白質的潛力，是長度大于200 nt的RNA，但它在肝癌發生過程中起著重要的作用，比如參加基因表達的調控，通過影響表觀遺傳水平、轉錄、以及轉錄后[6], 從而導致腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移以及細胞凋亡等，且與肝癌的發生和發展的機理和患者的預后有著緊密的關系[7- 8]。當今，在肝癌發生發展中LncRNA在其中的具體機制研究已經得到了重視，這給HCC的早期診斷、病情的控制以及預后的評估帶來了一個新的方式[9]。研究表明在肝癌患者中，有許多的LncRNA可以穩定的表達，這說明LncRNA有希望在肝癌早期的診斷、病情的控制以及預后的評估成為一種新的腫瘤標志物[9]。SNHG12 (小核仁RNA宿主基因12)是位于染色體1p35.3的腫瘤相關lncRNA。有報道稱SNHG12在多種腫瘤中失調，如膠質瘤、毛細管甲狀腺癌和胃癌，肝癌等，其致癌作用已被證。而在肝癌的發生發展中Notch信號通路也發揮著重要的作用，有研究表明，抑制SNHG12可以下調Notch1從而對細胞增殖、遷移和侵襲的影響[10]。

為了進一步研究SNHG12在HBx導致的肝癌過程中的作用，本課題通過穩定表達HBx的小鼠模型，模擬了最自然的感染HBV病毒的情況，檢測從HBx感染到HCC發生過程中，SNHG12以及其靶基因Notch1的動態變化，研究其潛在機制，為肝癌的早期診斷、藥物治療提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 肝前體細胞14-19、EGFP-14-19、HBx-EGFP-14-19由課題組前期構建，昆明(KM)小鼠來源于重慶醫科大學的動物中心，代養在無特殊病原體培養室[16]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(Vazyme)，辣根過氧化物酶標記二抗、SYBR Green mix試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒(碧云天生物技術公司)，DMEM高糖培養基(Gibco)，SNHG12的小分子RNA抑制劑(萊博斯生物技術有限公司)，血清(Cell Box)，β-actin、GAPDH和Notch1抗體(Cell Signaling Technology)，HBx抗體(Abcam)，Hes1、Bcl- 2、Bax抗體(上海泊灣生物科技)，CDK2和CyclinE 抗體(萬類生物科技有限公司)，ECL發光液、EndoFectinTM-MAX轉染試劑(GeneCopoeia)。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異基因 用R(4.0.2)版本在GSE93789芯片獲得數據，經pData函數獲得分組信息，exprs函數獲得表達矩陣并校正，進行數據轉換，獲取注釋信息，探針轉換與基因去重，進行差異分析，后續分析。最后篩選出具備表達差異的基因。

1.2.2 細胞培養 將課題組前期構建好的肝前體細胞14-19，EGFP-14-19和HBx-EGFP-14-19復蘇，按血清:培養基=1:9的比例在培養基中培養，放于5% CO2、37 ℃的培養箱中。

1.2.3 小鼠模型構建 將一個月左右的雄性KM小鼠30只，然后隨機分成3組:正常組-14-19組(n=5)、EGFP-14-19組(n=5)和 HBx-EGFP-14-19組(設4個時間點，共20只)。術前一天小鼠禁食，使用麻醉后將其固定在板上，用手擋住小鼠口鼻后噴酒精于腹部消毒，然后從腹中線剪開至暴露肝臟。找到肝門靜脈，分別緩慢注入14-19、EGFP-14-19以及HBx- EGFP-14-19細胞懸液(5×105個細胞/200 μL PBS)，注射完成后用棉球止血，最后縫合切口。在30 d、90 d、180 d和360 d 分別將小鼠進行安樂死，每個時間點的部分新鮮肝組織侵泡在4%的多聚甲醛中，剩下的保存于液氮中。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 按照試劑盒操作說明提總RNA后轉錄成cDNA，最后用無酶水稀釋10倍。保存于-20 ℃。反應體系為10 μL(SYBR Green:正向引物:反向引物:無酶水:cDNA模板=5:0.5:0.5:2:2)，內參為GAPDH，引物序列見表1。每個樣本3個復孔，每個3次。使用CFX Manager軟件分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot 檢測 按照RIPA裂解液操作說明( RIPA:PMSF=100:1)提取總蛋白，取小部分用BCA測蛋白濃度。剩余蛋白加入上樣緩沖液在100 ℃煮沸10～15 min后保留于-80 ℃。SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后TBST洗一次，孵一抗(1:1000)于4 ℃過夜。第二天用TBST洗3次，每次5 min后放于二抗孵育2 h，最后用ECL發光液顯影，以GAPDH及β-actin作為內參。

1.2.6 SNHG12的si-RNA si-RNA小分子干擾RNA的篩選：鋪板：將實驗分成5組(HBx、NC、si-RNA1-SNHG12、si-RNA2-SNHG12、si-RNA3-SNHG12組)，每組3個復孔，加入無雙抗培養基，每孔加入適量細胞，周圍一圈加入PBS，放于5% CO2、37 ℃的培養箱中培養24 h。轉染：先換液，每孔加50 μL培養基；用25 μL培養基稀釋siRNA，輕輕地吸吹3～5次混勻；輕輕地顛倒轉染試劑，用25 μL培養基稀釋，輕輕地吸吹3～5次混勻，室溫靜置5 min；混合轉染試劑和siRNA稀釋液，輕輕地吸吹3～5次混勻，室溫靜置20 min；將轉染復合物加到96空板中，50 μL一孔，混勻；將細胞放在5% CO2、37 ℃的培養箱中培養6 h后更換新的培養基，再培養24 h。提取細胞cDNA,進行PCR檢測。si-RNA小分子干擾RNA濃度的篩選：將實驗分成4組(濃度梯度為100 nm，50 nm，30 nm，10 nm)，每組3個復孔，步驟同上。

1.2.7 細胞劃痕實驗 用直尺均勻的在6孔板后劃線，每隔0.5～1 cm一道,每孔劃5條線，將HBx- EGFP-14-19細胞分成3組(HBx組、NC組、si-RNA1-SNHG12組)，每孔約5×105個細胞，次日，用槍頭垂直于橫線劃痕；PBS洗3次，洗去劃下的細胞后加無血清的培養基，拍照；放入5% CO2培養箱，37 ℃培養；24小時后取出，拍照。

1.2.8 CCK- 8實驗 將實驗分成4組[空白組、HBx組、空白對照(negative control,NC)組、si-RNA1-SNHG12組]，每組5個復孔，加入無雙抗培養基，每孔細胞數在2 000～5 000個，周圍一圈加入PBS，放于5% CO2、37 ℃的培養箱中培養24 h。轉染后6 h更換新的培養基，培養24 h，48 h，72 h。測OD值：每孔加10 μL CCK- 8溶液然后在培養箱中放置1～4 h，使用酶標儀測其吸光度(在450 nm處)。

1.2.9 流式細胞術 取6孔板長滿后的細胞，先將飄起來的細胞收集到離心管中，再用0.25%的不含EDTA的胰酶消化細胞，時間不宜太長。加入PBS緩沖液后離心(900 r/min，5 min)，棄上清，重復操作2次。最終將大約106個細胞重懸于500 μL PBS緩沖液中，裝在1.5 mL的EP管中即可用于凋亡檢測。

1.2.10 transwell實驗 細胞遷移：將培養試劑和transwell chamber放于37 ℃；取生長對數期的細胞消化后，用PBS、培養基(不含血清)依次洗一次，使細胞浮在培養基(無血清)上計數，讓細胞濃度大約為2×105/mL；在下室中加入700 μL含培養基(10%血清)，上室加150 μL的細胞；然后放入培養箱中24 h；第二天用鑷子拿出chamber，吸掉上室的液體，轉到提前裝有800 μL的甲醇孔里，室溫放置30 min；拿出chamber，吸掉上室的液體，轉到提前裝有800 μL的Giemsa染液孔里，室溫放置15～30 min；拿鑷子用清水輕輕地沖洗幾次，拿出chamber，吸掉上室的液體，然后用棉棒擦去上室的底部表面上的細胞；最后用鑷子取下膜，使它底面向上，晾干，拍照[11]。細胞侵襲：Matrigel在4 °C過夜;將放在4 °C預冷的培養基(無血清)稀釋至1 mg/mL，在冰上操作;然后在chamber上室加入100 μL稀釋后的Matrigel,放在37 °C使其干成膠狀;后續步驟同遷移實驗。

1.2.11 HE染色 石蠟切片脫蠟至水化，經過蘇木素(染細胞核)和伊紅(染細胞質)，然后脫水封片，最后顯微鏡觀察，分析切片。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 小鼠肝前體細胞中HBx 的表達及鑒定

通過復蘇培養前期構建的14-19，EGFP-14-19，HBx-EGFP-14-19細胞后，用RT-qPCR以及Western blot檢測均表明了HBx在HBx-EGFP-14-19細胞中成功表達，而14-19和EGFP-14-19細胞中則不表達(t=12.615，P<0.0001，圖1)，說明了HBx 在肝前體細胞能夠穩定表達。

圖1 細胞中HBx 的鑒定注：1: 14-19細胞;2: EGFP-14-19細胞;3:HBx-EGFP-14-19細胞;a:P<0.000 1,與14-19細胞、EGFP-14-19細胞比較；A，細胞中HBx mRNA的表達量;B，細胞中HBx蛋白的表達。

2.2 小鼠肝臟組織中HBx 的表達及鑒定

RT-qPCR結果顯示與14-19、EGFP-14-19細胞比較，HBx在HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d均高表達，在14-19、EGFP-14-19中無差別( F=123.466，P<0.0001，圖2A) ；Western blot顯示與14-19及EGFP-14-19組相比，HBx在HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d均高表達，在14-19、EGFP-14-19 組不表達(圖2B) 。RT-qPCR和Western blot均證明構建的HBx小鼠動物模型成功。免疫組化法結果顯示，HBx-EGFP-14-19組小鼠30 d、90 d、180 d、360 d各組肝臟組織均見HBx的陽性染色(圖2C)，RT-qPCR和Western blot以及免疫組化法均表明證明HBx在小鼠肝組織可長期穩定表達，動物模型構建成功。

2.3 小鼠肝腫瘤鑒定

HBx-EGFP-14-19組小鼠術后360 d處死時發現，肝臟組織有腫瘤生成(圖3A)。HE染色結果見(圖3B)，圖中標注1處細胞增大，且核仁偏大，核漿分布異常，核仁明顯；標注2處細胞呈多核，肝組織結構消失；標注3處肝細胞排列異常，呈多行排列。結果表明小鼠肝臟組織整體呈現壞死狀態，癌病灶處呈纖維化。小鼠肝臟發生惡性腫瘤病變。

圖3 小鼠肝臟組織腫瘤(A)和H-E染色(B)鑒定

2.4 SNHG12在GSE93789芯片中高表達

通過芯片中5組肝癌組織(HC)和癌旁組織(HN)比較，均顯示在肝癌組織中SNHG12表達上調(圖4)。

圖4 SNHG12在肝癌組織中的表達

2.5 HBx致癌過程中SNHG12及其下游因子的動態變化

RT-qPCR結果顯示與14-19、EGFP-14-19組比較，HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d，SNHG12及其下游靶基因Notch1、hes1在本小鼠模型中均上調(F=48.808，P< 0.000 1；F=13.322，P<0.000 1；圖5A，5B，5C)，Western blot結果也說明了Notch1、hes1在本小鼠模型中上調(圖5D)，以及與之相關的促凋亡因子Bax下調，抗凋亡因子Bcl- 2上調，細胞周期因子CDK2和Cyclin E上調(圖5E)；Western blot結果也表明和14-19、EGFP-14-19組比較，在HBx-EGFP-14-19中，SNHG12下游靶基因Notch1、hes1均上調(圖5F)，以及與之相關的促凋亡因子Bax下調，抗凋亡因子Bcl- 2上調，細胞周期因子CDK2和Cyclin E上調(圖5G)。這表明HBx在致癌的過程中可以通過上調SNHG12及其靶基因Notch1的表達，從而導致細胞周期和凋亡異常，而這個過程可能是HBx在HCC過程中的重要原因之一。

2.6 SNHG12的si-RNA

通過qRT-PCR結果顯示，最終確定si-RNA-1濃度為50 nm用于后續實驗研究(F=418.448，P<0.000 1，圖6A，6B)，Western blot結果顯示加入濃度為50 nm的si-RNA-1后SNHG12及其下游Notch1，Hes1等的表達被逆轉(圖6C，6D)。

圖6 加入SNHG12的si-RNA后SNHG12及其下游因子變化情況注：A:1:HBx組;2:NC組;3～5:分別為SNHG12-si-RNA-1、SNHG12-si-RNA- 2、SNHG12-si-RNA- 3組;a:P<0.000 1,與HBx組、NC組比較；B:1～4分別為:100 nm，50 nm，30 nm，10 nm；Ⅰ:1HBx-EGFP-14-19細胞組;Ⅱ: HBx-EGFP-14-19-NC細胞組;Ⅲ:HBx-EGFP-14-19-SNHG12-si-RNA細胞組；A、B:RT-qPCR檢測最佳SNHG12的si-RNA;C、D:Western blot檢測各組細胞Notch1、Hes1、CyclinE、CDK2、Bcl- 2、Bax的蛋白表達。

2.7 SNHG12的si-RNA對HBx-EGFP-14-19細胞表型的影響

通過細胞劃痕實驗和transwell實驗結果表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組遷移能力和侵襲能力明顯降低(7A，7B，7C)表明SNHG12的小分子干擾RNA可以抑制HBx-EGFP-14-19細胞的遷移侵襲能力；CCK- 8實驗表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組的增殖能力明顯降低(7D),表明SNHG12的小分子干擾RNA可以抑制HBx-EGFP-14-19細胞的增殖能力; 流式細胞術實驗表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組凋亡能力提高(7E)，表明SNHG12的小分子干擾RNA可以促進HBx-EGFP-14-19細胞的凋亡。

圖7 SNHG12的si-RNA對HBx-EGFP-14-19細胞表型的影響注：A，細胞劃痕實驗檢測各細胞的遷移；B、C，transwell實驗檢測各細胞的遷移侵襲；D，CCK8實驗檢測各細胞的增殖；E，流式細胞術實驗檢測各細胞的凋亡

3 討 論

長期以來，HBV的慢性感染一直被認為是HCC發生和發展的主要危險因素，導致全球超過一半的HCC病例[12-13]。HBx作為HBV病毒的核心蛋白HBx蛋白，它在HBV誘發成HCC過程中的作用主要包括：激活原癌基因、抑制抑癌基因、異常活化蛋白激酶、調控非編碼RNA(如：影響DNA甲基化、細胞增殖和惡性轉化以及遷移等)、促進炎癥反應、誘導氧化應激、發揮免疫抑制作用等[14-15]。目前傳統的診斷程序的局限性需要確定新的方法來改善對癌癥患者的診斷方法。

因為癌細胞和干細胞都可以進行自我更新和分化等特征，因此本研究選擇了課題組前期構建好的肝前體細胞，在構建動物模型中，與裸鼠或轉基因小鼠等模型相比，構建的昆明小鼠模型在自然條件下模擬了HBx感染的一個動態過程，能夠更好地研究HBx在體內的作用[16]。而lncRNAs已成為穩定的生物標記物，在肝癌中大量表達。重要的是，這些標記可以在腫瘤發育的所有階段都被檢測到，因此可能提供潛在的生物標記和治療靶點。

在GSE93789芯片中我們發現LncRNA SNHG12在肝癌組織比癌旁組織顯著上調，而SNHG12與許多癌癥有關，如乳腺癌、胃癌、骨肉瘤、神經膠質瘤和肝癌等。SNHG12表達的改變與腫瘤細胞的生存能力、增殖、轉移和侵襲性相關，影響癌癥患者的預后和生存率[5]。有研究表明，抑制SNHG12可以下調Notch1從而對對細胞增殖、遷移和侵襲的影響[10]。課題組前期結果說明，Notch信號通路在小鼠體內被HBx持續激活，導致細胞周期和細胞凋亡異常，從而引起HCC的發生發展[17]。而在我們前期構建好的HBx小鼠模型中與正常組和EGFP-14-19組相比SNHG12在30 d、90 d、180 d、360 d均高表達，說明SNHG12在HBx成瘤過程中可能有著密切的聯系。

為了進一步研究SNHG12在HBx成癌過程中的作用機制，我們用課題組前期構建成功的HBx-EGFP-14-19細胞，加入SNHG12的小分子干擾RNA，通過檢測其表型實驗發現，加入SNHG12的si-RNA后，細胞遷移、侵襲、細胞的增殖明顯被抑制，且促進了細胞的凋亡；Western blot實驗結果發現加入小分子干擾RNA后Notch1、hes1等明顯被抑制。本實驗進一步表明在HBx致癌過程中，抑制SNHG12的表達，可以抑制Notch1信號通路，抑制細胞遷移、侵襲和細胞增殖，以及促進細胞凋亡。

總之，在本實驗的昆明小鼠模型中，以最自然的狀態模擬了HBx感染的動態過程。在這個過程中HBx可以通過上調SNHG12，從而促使Notch1上調，導致細胞周期和凋亡異常，使其表型異常，因此在HBx誘導肝癌發生過程中SNHG12起著重要的作用。此外，長鏈非編碼不僅可以通過調節信號通路，還可以通過作為競爭性內源RNA在肝癌中起作用[18]。據報道，SNHG12也可以通過作為競爭性內源RNA在肝癌起作用。例如，SNHG12通過靶向miR-199a/b- 5p調節MLK3的表達并影響NF-κB通路，從而促進腫瘤發生和轉移[19]；SNHG12也可通過miR- 516a- 5p靶向HEG1促進肝細胞癌增殖和上皮間質轉化[20]。然而SNHG12在HCC過程中具體的作用機制本實驗只在體外細胞進行了機制研究，動物實驗機制還有待后續進一步研究，但課題組前期在該動物模型給與Notch的抑制劑時，其細胞周期、凋亡的相關因子表達均能夠逆轉，說明它在HCC過程中扮演者不可或缺的角色，可能成為一個有價值的生物標志物以及潛在的治療靶點。為了確定新的lncRNAs作為HCC的生物標志物，并闡明lncRNAs在HCC中如何工作的分子機制，未來的研究可能需要關注實驗技術的發展，例如新的測序技術，以及lncRNA生物信息學數據庫的發展[21]。