大黃素緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎痛的機(jī)制研究

成鼎文 朱海麗 謝 敏 劉 玲

湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北咸寧 437000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷及病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]，其病理機(jī)制與氧化應(yīng)激失調(diào)和免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）作為一種重要的抗氧化蛋白，可激活內(nèi)源性抗氧化通路，清除氧自由基，維持細(xì)胞氧化還原平衡，顯著抑制RA發(fā)展[3]。白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）是最常見的炎性細(xì)胞因子，在RA疼痛患者中，通過抑制IL-1β分泌，可顯著改善患者癥狀[4]。因此，激活內(nèi)源性抗氧化通路和抑制脊髓神經(jīng)炎癥可作為治療RA痛的一個有效手段。

大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌）是從藥用植物的根和樹皮中提取的衍生蒽醌化合物，其具有抗炎、抗氧化等特性[5]。為研究大黃素在RA疼痛中的作用，本研究中構(gòu)建佐劑型RA疼痛小鼠模型，大黃素腹腔給藥后檢測其對疼痛的緩解作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所使用的C57BL/6小鼠購自湖北省實驗動物中心[動物許可證號：SYXK（鄂）2018-0071]，共30只，6～8周齡，體重18～22 g。動物飼養(yǎng)在明暗交替的動物房中，并給予適量的食物和水。所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（2021-05-981）。

1.2 儀器及試劑

冰凍離心機(jī)（德國eppendorf公司，型號：5424R）；微型垂直電泳儀（北京韋克斯科技有限公司，型號：EP300）；迷你手持均質(zhì)儀（北京蘭杰柯科技有限公司，型號：L-C119-0502）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號：IX73P1F）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國GE公司，型號：29-0050-63）。

大黃素（上海源葉生物科技有限公司）；完全弗式佐劑、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、SDSPAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；本實驗所用一抗如下：兔抗核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、兔抗β肌動蛋白（β-actin）和兔抗IL-1β均購于Affinity公司；兔抗NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor 3，NLRP3）、兔抗環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）和兔抗Nrf2均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，兔抗小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白游離鈣結(jié)合適配器蛋 白1（ionized calcium binding adapter protein 1，Iba1）購于碧云天生物科技有限公司；所用二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 動物造模與給藥處理

將30只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和大黃素給藥組，每組各10只。模型組和大黃素給藥組采用左膝關(guān)節(jié)注射完全弗式佐劑造模。動物適應(yīng)1周后，開始造模，具體流程如下：完全弗式佐劑與生理鹽水1∶1稀釋，采用水合氯醛麻醉，小鼠左腿剃毛，使用無菌微量注射器向小鼠左膝關(guān)節(jié)內(nèi)緩慢注射完全弗式佐劑混懸液（40 μl），隨后用碘伏消毒傷口。建模持續(xù)14 d，14 d后觀察造模部位，若皮膚發(fā)紅腫脹或膝關(guān)節(jié)有紅腫，則視為造模成功。造模成功后，10 mg/kg大黃素腹腔給藥處理小鼠，連續(xù)給藥3 d，3 d后檢測所有動物行為學(xué)變化，行為學(xué)檢測完以后進(jìn)行動物麻醉處死，脊髓取材用于后續(xù)實驗研究。

1.4 動物行為學(xué)實驗

1.4.1 自發(fā)縮足反射次數(shù)記錄 將小鼠置于20 cm×20 cm×20 cm的透明玻璃盒內(nèi)，實驗開始前適應(yīng)20 min，過程中觀察并記錄每5 min內(nèi)小鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)，記錄3次，計算其縮足反射平均值。

1.4.2 縮足閾值檢測 將動物放置于20 cm×20 cm×20 cm的透明正方體玻璃盒內(nèi)，適應(yīng)30 min后，用Von Frey纖維（0.16～2.0 g）垂直刺激小鼠左側(cè)后肢足底正中，持續(xù)時間≤5 s，出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測。根據(jù)公式50% PWT（g）=（10[Xf+Kδ]）/10 000計算各組小鼠的縮足閾值。

1.4.3 轉(zhuǎn)棒運動實驗 正式實驗開始前3天每天將小鼠放在轉(zhuǎn)棒儀器上適應(yīng)，設(shè)置參數(shù)勻速4 r/min的速度適應(yīng)10 min，間隔休息30 min，重復(fù)3次。正式實驗時以10 r/min運動10 s，勻加速10 s，以20 r/min運動30 s，勻加速10 s，以20 r/min運動9 min。記錄實驗動物運動的距離和在轉(zhuǎn)棒上停留的時間。

1.5 免疫印跡（Western blot）

過量麻醉處死小鼠分離腰段脊髓，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解、勻漿、4℃條件下12 000 r/min離心15 min后取上清，BCA蛋白測定試劑盒檢測其蛋白濃度；SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，孵育一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，用LAS500凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，凝膠成像Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對RA痛小鼠行為學(xué)的影響

模型組小鼠的縮足閾值、轉(zhuǎn)棒停留時間和運動距離均低于對照組，自發(fā)縮足次數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），表明RA小鼠痛覺過敏并伴有運動功能的降低；大黃素給藥組小鼠的縮足閾值、停留時間和運動距離均高于模型組，自發(fā)縮足次數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），表明大黃素腹腔給藥可顯著改善RA小鼠的運動能力。見表1。

表1 大黃素對RA痛小鼠行為學(xué)的影響（±s）

表1 大黃素對RA痛小鼠行為學(xué)的影響（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05

組別 n 縮足閾值（g） 自發(fā)縮足次數(shù)（次/5 min） 轉(zhuǎn)棒停留時間（s） 運動距離（m）對照組 10 1.186±0.215 2.700±0.675 569.415±41.067 23.176±4.511模型組 10 0.326±0.146a 6.100±1.287a 267.048±76.599a 9.173±3.820a大黃素給藥組 10 1.083±0.114ab 4.500±1.178ab 469.661±93.014ab 18.596±4.851ab F值 108.800 95.270 43.940 24.900 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，模型組小鼠的脊髓組織Iba1和COX-2蛋白表達(dá)高于對照組，Nrf2蛋白表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；大黃素給藥組小鼠的脊髓組織Iba1和COX-2蛋白表達(dá)低于模型組，Nrf2蛋白表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1、表2。

圖1 小鼠脊髓組織Iba1、Nrf2和COX-2蛋白表達(dá)結(jié)果

表2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白相對表達(dá)水平（±s）

表2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白相對表達(dá)水平（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05；Iba1：小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白游離鈣結(jié)合適配器蛋白1；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；COX-2：環(huán)氧化酶2；β-actin：β肌動蛋白

組別 n Iba1/β-actin Nrf2/β-actin COX-2/β-actin對照組 10 1.000±0.031 1.000±0.023 1.001±0.013模型組 10 1.132±0.037a 0.959±0.031a 2.436±0.113a大黃素給藥組10 0.771±0.017ab 1.918±0.071ab 1.250±0.113ab F值 75.690 310.100 358.800 P值 0.001 0.002 0.003

2.3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)情況

western blot結(jié)果顯示，模型組小鼠的脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；大黃素給藥組小鼠的脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖2、表3。

圖2 小鼠脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)結(jié)果

表3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白相對表達(dá)水平（±s）

表3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白相對表達(dá)水平（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05；NF-κB：核因子κB；NLRP3：NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3；IL-1β：白介素1β；β-actin：β肌動蛋白

組別 nNF-κB/β-actinNLRP3/β-actinIL-1β/β-actin對照組 10 1.000±0.040 1.000±0.036 1.000±0.042模型組 10 1.208±0.048a 2.094±0.017a 1.154±0.032a大黃素給藥組10 1.034±0.031ab 1.252±0.071ab 1.070±0.021ab F值 64.550 322.400 26.220 P值 0.015 0.001 0.029

3 討論

研究表明大黃素在多種病理性疼痛進(jìn)程中發(fā)揮作用，在慢性炎癥痛大鼠模型中，腹腔注射大黃素降低血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）/IL-1β和IL-6的水平并緩解大鼠機(jī)械痛和熱痛[6]。在慢性縮窄性損傷神經(jīng)痛模型中，大黃素降低背跟神經(jīng)節(jié)中初級感覺神經(jīng)元嘌呤P2X受體的表達(dá)并減輕大鼠痛覺過敏[7]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素在RA疼痛模型中可有效緩解小鼠自發(fā)痛和機(jī)械痛。因此，大黃素可作為治療病理性疼痛的藥物，具有較好的醫(yī)用前景。

NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的脊髓炎癥多種病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。NLRP3被刺激后與接頭蛋白ASC組裝成復(fù)合物，催化caspase-1激活，將無活性的pro-IL-1β裂解為具有促炎活性的IL-1β并釋放[8]。在患有纖維肌痛和Schnitzler綜合征（一種罕見的以關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病）的患者血液中發(fā)現(xiàn)了NLRP3和IL-1β表達(dá)增加。同時在疼痛動物模型包括炎癥痛、神經(jīng)痛、癌痛以及RA痛中均報道了NLRP3表達(dá)和激活增加以及IL-1β的產(chǎn)生增加[9]。進(jìn)而NF-κB激活可促進(jìn)無活性NLRP3和pro-IL-1β轉(zhuǎn)錄，上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)水平[10]。在胰腺癌[11]和肥胖哮喘[12]模型中發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制NF-κB信號活性及IL-1β水平從而發(fā)揮保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素可降低脊髓中NF-κB、NLRP3和IL-1β的表達(dá)，具有抑制脊髓炎癥的效果。

Nrf2及其下游靶點與炎癥和病理性疼痛相關(guān)。過量的活性氧導(dǎo)致慢性疼痛的發(fā)展，Nrf2激活可增加抗氧化激酶的基因轉(zhuǎn)錄包括血紅素加氧酶-1、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶等，降低活性氧的水平進(jìn)而緩解疼痛[13]。同時Nrf2激活還可抑制NF-κB核蛋白和炎癥因子的表達(dá)[14]。研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病模型中，大黃素增加Nrf2、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶活性從而改善小鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素給藥可升高脊髓Nrf2表達(dá)并降低COX-2表達(dá)，從而減輕脊髓氧化應(yīng)激水平。

本研究的創(chuàng)新點在于將脊髓炎癥及氧化應(yīng)激與大黃素的鎮(zhèn)痛效果聯(lián)系在一起，并為大黃素的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制作出解釋。同時，局限性在于給藥方式為腹腔給藥，大黃素起效劑量和代謝率不能準(zhǔn)確定量，在進(jìn)一步研究中可改用靜脈給藥或鞘內(nèi)給藥，從而明確大黃素藥物劑量與鎮(zhèn)痛功效的關(guān)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大黃素可激活抗氧化Nrf2途徑降低NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號并發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，有助于大黃素作為RA痛的鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)研究。