基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討熟地黃-山茱萸治療2型糖尿病的作用機(jī)制

曲國林 付丹妮 遲鵬程 甄 東▲

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼 028000

糖尿病是以胰島素抵抗或胰島素作用障礙引起的高血糖為特征的代謝性疾病，具有遺傳易感性。我國糖尿病患病率持續(xù)升高，給我國公共衛(wèi)生帶來了極大的負(fù)荷[1]，糖尿病中發(fā)病率最高的為2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）。中醫(yī)理論認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇，中醫(yī)所云的消渴癥可分為上、中、下三消，即病情的輕度、中度、嚴(yán)重[2-3]。下消一般病在腎虛，又有陰虛及陰陽兩虛之別。熟地黃-山茱萸藥對是治療腎病的常用藥對[1]。熟地黃是生地黃的炮制加工品，其外表光澤烏黑，質(zhì)地柔軟堅(jiān)韌，味道甘甜，性微溫，主要治療肝臟、腎臟虛弱、心跳悸動怔忡、月經(jīng)不調(diào)等病癥[4]。山茱萸性微溫、味道微酸，有滋補(bǔ)活絡(luò)、澀精固脫的功效，主治腰痛酸軟、陽痿遺精、小便次數(shù)多等病癥[4]，兩者配伍多用于補(bǔ)腎填精、益精填髓。

中藥具有多途徑、多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[5]。而糖尿病也是多基因、多通路作用的疾病，所以，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)工具分析并預(yù)測熟地黃-山茱萸治療糖尿病的分子機(jī)制是可行的[6-7]。故本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從中藥成分-靶點(diǎn)-通路-疾病角度探討熟地黃-山茱萸治療T2DM可能的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 熟地黃-山茱萸活性成分的收集與篩選

運(yùn)用BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具）數(shù)據(jù)庫收集熟地黃和山茱萸所有的有效活性基因分子[8]，在設(shè)置參數(shù)處選用分?jǐn)?shù)截至值為20，P值為0.05，然后進(jìn)行篩選，得到其有效活性成分[9]。

1.2 對T2DM的作用靶點(diǎn)及熟地黃-山茱萸的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測

運(yùn)用OMIM（online Mendelian inheritance in man）（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫，GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“T2DM”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，對T2DM的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。對BATMANTCM數(shù)據(jù)庫篩選出的熟地黃、山茱萸可能的靶點(diǎn)與Drugbank（https://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，預(yù)測可能的有效活性成分靶點(diǎn)[10]。

1.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入軟件中，進(jìn)行可視化分析，繪制活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖[11]。

1.4 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-T2DM網(wǎng)絡(luò)圖

以“T2DM”為輸入項(xiàng)進(jìn)行搜索，將DisGeNET、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建“T2DM-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并將疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)輸入在線Venny平臺，獲得交集靶點(diǎn)，然后將所獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件當(dāng)中繪制出“活性成分-靶點(diǎn)-T2DM”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 進(jìn)行基因的GO分析和通路分析

運(yùn) 用DAVID數(shù) 據(jù) 庫 和Metascape（http://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫以P＜ 0.01作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO富集分析以及KEGG功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 篩選收集出熟地黃以及山茱萸的有效活性成分

運(yùn)用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選出熟地黃以及山茱萸的有效活性成分共54種，其中熟地黃8種、山茱萸46種。

2.2 熟地黃以及山茱萸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

進(jìn)一步篩選出熟地黃、山茱萸共19種有效活性成分（score大于48）及相對應(yīng)的靶點(diǎn)256個節(jié)點(diǎn)和319條邊組成活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），每個活性成分對應(yīng)多個靶點(diǎn)。在19種活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)中，根據(jù)所顯示節(jié)點(diǎn)數(shù)量，成分靠前的分別是Alpha-corocalene、Aristolone、Isoamyl Alcohol、Isotetrandrine，可初步認(rèn)為其為藥物中發(fā)揮主要作用的成分。

圖1 熟地黃-山茱萸成分所對應(yīng)的靶標(biāo)

2.3 構(gòu)建熟地黃-山茱萸活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集到的T2DM的作用靶點(diǎn)共1183個，篩選出作用靶點(diǎn)450個（相關(guān)數(shù)值大于0.5），二者相互交集的靶點(diǎn)24個（圖2）。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape軟件，繪制建立出有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖2 熟地黃-山茱萸活性成分靶點(diǎn)與T2DM靶點(diǎn)關(guān)系Venn圖

圖3 熟地黃-山茱萸有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO通道路徑富集分析

GO富集分析發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)主要富集269個生物學(xué)過程（BP）、55個細(xì)胞成分（CC）以及90個分子功能（MF）中，分別根據(jù)富集倍數(shù)數(shù)值選擇其中最高的前10位繪制富集氣泡圖（圖4～6）。GO富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞成分（圖4）中富集倍數(shù)較大的有細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外液、細(xì)胞外區(qū)、質(zhì)膜等，生物學(xué)過程（圖5）主要富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，分子功能（圖6）主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。

圖4 細(xì)胞成分分析（前10位）

圖5 生物學(xué)過程分析（前10位）

圖6 分子功能分析（前10位）

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)主要富集在24條通路（圖7），與營養(yǎng)信號通路、胰島素抵抗、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等關(guān)系相對密切，提示熟地黃-山茱萸可能通過營養(yǎng)成分介導(dǎo)胰島素等方面治療T2DM。

圖7 有效成分及疾病作用靶點(diǎn)的KEGG富集通道路徑分析

3 討論

T2DM發(fā)病趨勢連年升高，發(fā)病機(jī)制主要為患者自身胰島素分泌受限[12]。部分T2DM患者以胰島素抵抗為主，血液中的胰島素升高以代償其胰島素抵抗[13-15]。糖尿病在中醫(yī)中被稱為“消渴”，患者多為陰虛火旺盛體質(zhì)，由飲食無節(jié)制、好食肥甘厚味、缺少運(yùn)動、經(jīng)常久坐等諸多因素造成，臨床表現(xiàn)為陰氣虛弱氣火旺盛、津傷燥結(jié)、淤積氣血等，熟地黃、山茱萸是中醫(yī)常用補(bǔ)腎填精復(fù)方藥對之一。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從中藥成分-靶點(diǎn)-通路-疾病角度預(yù)測熟地黃、山茱萸藥對治療T2DM的分子機(jī)制。

本研究通過收集活性成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，得到成分-疾病的交集靶點(diǎn)，最后進(jìn)行功能注釋富集分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過程主要富集在對基因的調(diào)節(jié)、調(diào)控等方面。KEGG的通道路徑富集分析發(fā)現(xiàn)其涉及如營養(yǎng)信號通路、胰島素抵抗等多條信號通路。胰島素抵抗發(fā)生有多種機(jī)制，如線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及炎癥等。研究發(fā)現(xiàn)o-glcnac水平提升與高糖引發(fā)導(dǎo)致的胰島素抵抗有關(guān)，供體udp-glcnac通過己糖生物合成途徑誘導(dǎo)，通過o-glcnac轉(zhuǎn)移酶添加到蛋白質(zhì)中，o-glcnac修飾的提高改變了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的功能和磷酸化，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)級聯(lián)減弱[13，16-17]。另外，本研究存在一定的局限性，在后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)一步分析中應(yīng)加入活性化合物和活性靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證,以進(jìn)一步說明熟地黃-山茱萸藥對治療T2DM的分子機(jī)制。同時，后續(xù)還需在體內(nèi)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測機(jī)制。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，發(fā)現(xiàn)熟地黃-山茱萸可能通過營養(yǎng)治療以及介導(dǎo)胰島素等多途徑治療T2DM，為后續(xù)研究提供方向。