高溫大曲貯存過程中部分理化指標與微生物群落演替變化規律研究

汪彩莉，程險峰，李曉環，張 虎

（湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北松滋 434200）

曲是一種糖化發酵劑，是釀酒的原動力，要釀好酒先得制曲，要釀好酒必須用好曲[1]。大曲不僅是一種糖化發酵劑，對成品酒的香型、風格也起著重要作用[2]。大曲中含有豐富的微生物，主要包括細菌、霉菌和酵母菌三大類，糖化看霉菌，酵母來發酵，生香靠細菌。制好的大曲都需要經過貯存再投入生產使用，這樣可以提高大曲酒的質量，因此貯存是制成高質量大曲必不可少的步驟。

白云邊酒生產采取高溫曲和中溫曲分開制曲，結合使用的方式進行，形成了白云邊酒特有的制曲工藝體系[3]。高溫大曲以純小麥為原料，經高溫培養而成，最高溫度控制在65 ℃。培菌完成的大曲運至貯曲庫，貯存3～6 個月后，用于釀酒。本課題以貯存中的高溫大曲為研究對象，旨在發現貯存過程中高溫大曲主要理化指標和微生物生長情況的變化規律，以及兩者間的相關性，用于指導高溫大曲貯存工作，提高陳曲質量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

樣品來源：各階段高溫大曲均由湖北白云邊酒業股份有限公司原料車間提供。

樣品處理：選取4 班、5 班、6 班高溫大曲若干塊，單獨放于成品曲倉庫內。每次測量時，從同批次曲塊上敲取部分曲塊粉碎后混勻裝入無菌密封碗中并立刻處理。

1.1.2 試劑

平板計數瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；孟加拉紅培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

0.1mol/L NaOH 溶液：稱取4 g 分析純氫氧化鈉，加少量水溶解，稀釋至1 L，搖勻，儲存于聚乙烯瓶中（不必標定其濃度）。

斐林氏試液（稀）

甲液：稱取15 g 硫酸銅、0.5 g 次甲基藍，用水溶解并稀釋至1 L。

乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉、54 g氫氧化鈉、4 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至1 L。

1.0g/L葡萄糖標準溶液：準確稱取已烘干的無水葡萄糖1.0g，用水溶解，加5 mL 濃鹽酸（防腐），用水稀釋至1 L。

20 g/L 淀粉溶液：稱取10.00 g 預先于100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水調成糊狀，不斷攪拌下注入400 mL 的沸水，繼續煮沸至透明，冷卻后，500 mL 容量瓶中定容至刻度，搖勻。此溶液必須現配現用，若用量較小，可按比例適當減少配制。

1.1.3 儀器設備

超凈操作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；搖床，上海知楚儀器有限公司；紫外/可見分光光度計，翰藝儀器（上海）有限公司；電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；pH 計，奧豪斯儀器（常州）有限公司等。

1.2 試驗方法

1.2.1 水分、糖化力測定

按照QB/BGJ5.01—-2014《制曲檢測方法》測定。

1.2.2 酶活測定[4]

1.2.2.1 待測酶液的制備

稱取10.00 g 大曲粉，用少量磷酸緩沖液充分溶解，40 ℃水浴鍋中浸取2 h，每隔15 min 攪拌一次（保證酶液完全浸取出來，并將大曲自身的淀粉消耗殆盡）。將上清液傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，加少量磷酸緩沖液充分研磨,最終樣品全部移入100 mL 容量瓶中，磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過濾,濾液待用。

1.2.2.2 制作淀粉溶液濃度梯度與吸光度的標準曲線

淀粉標準溶液的制備：稱取1.50 g淀粉，定容至250 mL容量瓶中。制作淀粉濃度為0 g/L、0.075 g/L、0.15 g/L、0.30 g/L、0.45 g/L、0.60 g/L、0.90 g/L 的標準溶液，測定其在660 nm 處的吸光度，制作淀粉濃度與吸光度標準曲線。

圖1 淀粉濃度對應吸光度標準曲線

1.2.2.3 測定

吸取10.0 mL 可溶性淀粉溶液、10 mL 無菌水、5 mL 磷酸緩沖溶液于150 mL 三角瓶中，搖勻后，置于60 ℃的恒溫水浴中預熱8 min。加1.00 mL 稀釋好的待測酶液立即計時，搖勻，準確反應10 min。用自動移液器吸取1.00 mL 反應液（空白對照樣加入1.00 mL 磷酸緩沖液），加到預先盛有0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL稀碘液的試管中，搖勻，以0.5 mL鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液為空白，于660 nm 波長下,測定其吸光度(A)。

根據標準曲線的公式y=0.8475x-0.0145，假設y0為空白對照樣淀粉濃度，y 為待測樣淀粉濃度。代入公式計算反應過程中淀粉的消耗量，y0-y=0.8475(x0-x），根據α-淀粉酶活力定義計算α-淀粉酶活力X：

式中：X——樣品的酶活力，u/mL；

c——測試酶樣濃度，u/mL；

v——反應中加入待測酶液量，mL；

t——反應時間，min。

式中c=0.1 g/mL；v=1.00 mL；t=10 min。

1.2.3 微生物計數稱取10 g 處理好的高溫大曲曲粉，置于裝有90 mL 無菌水的三角瓶中，120 r/min 搖床，振蕩15 min左右，使曲粉充分混勻。在無菌操作臺上，進行梯度稀釋，吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度溶液100 μ L，涂布于孟加拉紅平板和瓊脂計數平板。28 ℃倒置培養2～3 d，即可長出細菌和真菌菌落。對培養好的平板進行計數。

2 結果與分析

2.1 白云邊高溫大曲在貯存過程中部分理化指標變化規律

2.1.1 水分變化情況

由表1 可知，在貯存15 d 和30 d 時，水分不降反升，而且升幅較大。高溫大曲在經過45～50 d的培養后，品溫逐漸降低至室溫接近，曲醅基本干燥。在前一個月的貯存時間內，大曲從外界吸水，增加了大曲含水量；在第2～5 個月，大曲水分趨于穩定，在11 %左右波動。大曲水分隨貯存時間的延長變化不大。水分受環境因素影響很大，白云邊貯曲庫要求通風、防潮、防蟲，是一個相對穩定的環境，所以水分變化不大。

表1 大曲水分隨貯存時間的變化情況(%)

2.1.2 酸度變化情況

由表2 可知，大曲酸度隨貯存時間的延長有輕微波動，但變化不大，維持在一個相對穩定的水平。

表2 大曲酸度隨貯存時間的變化情況(%)

2.1.3 糖化力變化情況

由圖2 可知，剛出培菌房的大曲糖化力都很低，隨著貯存時間的延長，糖化力逐漸增加，當貯存時間達到90 d時，糖化力達到最大值。后期隨著貯存時間的延長，糖化力呈現緩慢下降的趨勢。在150 d的貯存期內，糖化力先增后減。

圖2 貯存過程中高溫大曲糖化力變化情況

2.1.4 酶活變化情況

由圖3 可知，大曲酶活與糖化力變化規律一致，先增加后減少，90 d 為轉折點。相對于4 班和5班，6班的酶活相對較小，與糖化力情況相同。

圖3 貯存過程中高溫大曲酶活變化情況

2.2 微生物計數

2.2.1 細菌總數

由表3 可知，在150 d 的貯存期內，大曲中細菌數量逐步降低。剛出房時細菌含量為107CFU/g，貯存150 d 時，細菌含量為105CFU/g，細菌含量逐步下降。在貯存過程中，白云邊貯曲庫要求通風、防潮,大曲含水量變化不大，故細菌數量逐步下降。

表3 貯存過程中高溫大曲細菌總數 (CFU/g)

2.2.2 霉菌總數

由表4 可知，霉菌數量隨貯存時間先增加后降低。剛出房的大曲中霉菌含量很少，培菌房內高溫抑制了霉菌生長。在成曲庫貯存15 d后，曲庫溫度為室溫，適于霉菌生長，霉菌成數量級的增長，后增長放緩。4 班和6 班在75 d 時，霉菌數量達到最大值，5 班在90 d 時，霉菌數量達到最大值。后隨著貯存時間的延長，霉菌數量逐漸減少。霉菌數量與糖化力和酶活變化規律一致，呈正相關性。

表4 貯存過程中高溫大曲霉菌數量 (CFU/g)

3 結論

研究表明，在高溫大曲5 個月的貯存時間內，隨著貯存時間的延長，水分變化不大，酸度維持在一個穩定水平，糖化力和酶活先增加后減少，微生物方面，細菌逐步減少，酵母菌難以檢測到，霉菌先增加后減少。

大曲水分受曲庫環境影響，曲庫要求通風，防潮，防蟲，所以變化不大。但曲庫相對于培菌房來說很干燥，不利于細菌富集，細菌含量不斷下降。培菌房內高溫抑制了霉菌生長，大曲出房后，曲庫中溫度更利于霉菌生長，霉菌貯存前期增長迅速，后面有所下降。

大曲中的酸度有兩大來源，最主要的是醋酸菌和乳酸菌代謝產生的醋酸和乳酸，其次，脂肪、淀粉和蛋白質的降解也會產生酸[4]。貯存過程中細菌不斷減少，使大曲酸度降低，但微生物不斷生長繁殖的過程中產生的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等會水解淀粉、蛋白質和脂肪產生酸，所以大曲酸度維持在一個相對穩定的狀態。

細菌數量逐步減少，與大曲儲存是減少產酸菌數量的認知是一致的[5]。大曲的儲存時間越長，細菌含量越少，在釀造發酵過程中可以避免酒醅產生過多的酸。在貯存過程中，大曲糖化力和酶活與霉菌數量成正相關性，都是先增后減，驗證了糖化力看霉菌的說法。糖化力、酶活、霉菌數量的轉折點是90 d，3個月后，糖化力、酶活、霉菌數量均逐步下降。儲存時間越長，大曲糖化力、酶活、霉菌數量越低，不利于發酵。大曲貯存時間最長不應超過一年，貯存時間過長影響窖內發酵，同時增加曲蟲危害和曲庫成本。儲存時間低于3 個月的大曲，細菌含量高，一般不用于生產。在實際生產中，白云邊一般選用貯存3～6 個月的大曲用于釀造生產，大曲質量較高。