響應(yīng)面優(yōu)化HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

郭磊，李為蘭，魯斌，王德新，劉云，王軍民

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校大健康類森林資源開發(fā)利用工程研究中心,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是食用菌的重要感官指標(biāo),也是評(píng)價(jià)其成熟度、加工方式及品質(zhì)的重要指標(biāo),主要包括八碳化合物、含硫化合物、醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等[1-2]。八碳化合物和含硫化合物因含量豐富且識(shí)別閾值低,對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的影響較大,故被公認(rèn)為是食用菌中的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[3]。揮發(fā)性八碳化合物是食用菌中最重要的風(fēng)味物質(zhì),具有濃郁的蘑菇味,最具代表性的是1-辛烯-3-醇[4]。揮發(fā)性含硫化合物是構(gòu)成食用菌中風(fēng)味物質(zhì)的另一種重要化合物,能夠影響食用菌的整體風(fēng)味。Morita等[5]最早從香菇中分離出1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷(香菇素, lenthionine),被認(rèn)為是香菇最重要的揮發(fā)性含硫化合物。之后,越來越多的揮發(fā)性含硫化合物從食用菌中被檢測(cè)出來,包括硫醚類、硫醇類和含硫雜環(huán)化合物等。醛類、酮類、酸類、酯類及其他雜環(huán)類化合物也呈現(xiàn)出食用菌的特殊香味[6]。復(fù)合調(diào)味料是一種兼具天然、便利、營養(yǎng)及風(fēng)味等特點(diǎn)的新型產(chǎn)品,在我國的生產(chǎn)和應(yīng)用歷史非常悠久,一款營養(yǎng)價(jià)值高、色香味俱佳的復(fù)合調(diào)味料會(huì)越來越受到人們的歡迎[7-8]。因此,分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并研究其在不同食品加工過程中的變化規(guī)律,不僅可以在食用菌加工過程中進(jìn)行風(fēng)味品質(zhì)控制,還可以促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)特別是復(fù)合調(diào)味品產(chǎn)業(yè)的開發(fā)升級(jí)。

目 前,食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取方法主要有頂空分析法(HS)、固相微萃取法(SPME)、同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)、超臨界CO2流體萃取法等[9],其中,HS-SPME集采樣、萃取、濃縮及樣品導(dǎo)入于一體,具有高效快速、靈敏度高、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[10],在食用菌[11]、醋[12]及醬料[13]等食品工業(yè)中有著十分廣泛的應(yīng)用。美味牛肝菌(BoletusedulisBull.)屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、牛肝菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬[14]。中國是美味牛肝菌的主產(chǎn)區(qū),主要分布于西南和東北森林資源富集區(qū),以西南地區(qū)的種類最豐富,而云南產(chǎn)量最大[15-16]。新鮮美味牛肝菌含水量高、呼吸作用強(qiáng),易發(fā)生褐變、萎蔫等現(xiàn)象，導(dǎo)致商品價(jià)值降低,干燥能夠降低美味牛肝菌中的水分含量,抑制酶的活性及微生物的生長繁殖,從而延長貨架期[17]。然而,不同干燥方法對(duì)美味牛肝菌干制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響不同。本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)條件,并結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分別對(duì)恒溫干燥、真空干燥及真空冷凍干燥后美味牛肝菌傘部、桿部的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,比較3種干燥方式對(duì)美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,以期為美味牛肝菌資源的綜合利用及其調(diào)味品研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮美味牛肝菌:2021年7月購自昆明市木水花食用菌交易市場(chǎng)。新鮮美味牛肝菌經(jīng)挑選、清洗后擦干,將傘部、柄部分別切成1 cm的薄片,分別置于70 ℃恒溫干燥、70 ℃真空干燥及真空冷凍干燥至恒重,粉碎過篩后備用。

BSA224S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;FreeZone?(Plus) 4.5 L冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司;RCH-1000頂空固相微萃取裝置 上海愛朗儀器有限公司;7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司;57328-U型50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萃取頭使用

初次使用萃取頭時(shí)需在GC進(jìn)樣口以270 ℃老化2 h,以后使用前將萃取頭在270 ℃活化30 min后即可。相同條件下做數(shù)次空白直至無干擾峰出現(xiàn)。

1.2.2 HS-SPME條件

精確稱取不同部位美味牛肝菌樣品(0.500 g)于20 mL棕色頂空瓶中,迅速將已老化好的萃取頭插入頂空瓶中進(jìn)行吸附,待吸附結(jié)束后迅速將萃取頭拔出并插入到進(jìn)樣口進(jìn)行解吸和檢測(cè)。

圖2為污水流速對(duì)水側(cè)換熱系數(shù)的影響.從圖上可知，污水流速為0.2 m/s對(duì)水側(cè)換熱系數(shù)的影響很大，換熱系數(shù)由4 368增大到5 545 W/m2·K，增大約27%，而后當(dāng)污水流速再增大到0.25 m/s，水側(cè)換熱系數(shù)約6 048 W/m2·K，增大為僅9%.說明從0.2 m/s后，污水速度提高對(duì)水側(cè)換熱系數(shù)影響趨勢(shì)不太明顯.

1.2.3 GC-MS分析

GC-MS條件:HP-5MS 揮發(fā)性色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣(He)流速為1.0 mL/min;升溫程序:初始溫度40 ℃并保持5 min,然后以5 ℃/min升溫至260 ℃保持2 min;不分流模式進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度為250 ℃。質(zhì)譜條件:EI源,70 eV,傳輸線溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描方式為全掃描,質(zhì)量掃描范圍30～400 m/z。

檢測(cè)后經(jīng)NIST Library 14.0譜庫檢索,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定其成分組成,采用相似度大于80(最大值100)的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇解吸時(shí)間15 min,單因素試驗(yàn)如下:固定萃取時(shí)間30 min、平衡時(shí)間20 min,研究不同溫度(70,75,80,85,90 ℃)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響;固定萃取溫度80 ℃、平衡時(shí)間20 min,研究不同萃取時(shí)間(20,25,30,35,40 min)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響;固定萃取溫度80 ℃、萃取時(shí)間20 min,研究不同平衡時(shí)間(10,15,20,25,30 min)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)中心組合設(shè)計(jì)的原理,選擇萃取溫度、萃取時(shí)間及平衡時(shí)間為影響因素,各因素及水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

利用軟件Design Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,獲得美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B) 及平衡時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型,回歸方程為Y=29.40-0.87A-1.50B-0.88C+AB-1.25AC+1.50BC-3.08A2-1.83B2-2.07C2。

對(duì)回歸模型及各因素進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation ofresponse surface test

續(xù) 表

由表3可知,模型的P值<0.000 1,說明回歸模型極顯著(P<0.01),而失擬項(xiàng)的P=0.367 8,不顯著(P>0.05),表明回歸方程擬合度良好。模型決定系數(shù)R2=0.981 4,RAdj2=0.957 5,表明回歸方程與實(shí)際值具有高度擬合性,可以用此模型來對(duì)HS-SPME-GC-MS法萃取美味牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。另外,模型中的一次項(xiàng)A、B、C,交互項(xiàng)AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)AB對(duì)萃取效果的影響顯著(P<0.05)。3個(gè)因素對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰數(shù)(Y)影響效果的主次順序依次為萃取時(shí)間(B)>萃取溫度(A)=平衡時(shí)間(C),因素兩兩交互作用的響應(yīng)面結(jié)果見圖1。

圖1 萃取溫度、萃取時(shí)間、平衡時(shí)間兩兩交互作用對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響Fig.1 Effects of interaction of extraction temperature, extraction time and equilibrium time on extraction effect of volatile flavor substances

對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)得到HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌揮發(fā)性物質(zhì)的最佳條件為萃取溫度79.05 ℃、萃取時(shí)間27.88 min、平衡時(shí)間23.42 min，預(yù)測(cè)美味牛肝菌揮發(fā)性物質(zhì)峰個(gè)數(shù)為30.04個(gè)。

2.2 模型驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)際條件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行修正并驗(yàn)證，選擇萃取溫度79 ℃、萃取時(shí)間28 min及平衡時(shí)間23 min，在此條件下最終得出美味牛肝菌傘部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共31種，與預(yù)測(cè)值相差0.03%，表明此數(shù)學(xué)模型有著良好的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性。

2.3 美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用最優(yōu)的HS-SPME條件分別對(duì)70 ℃恒溫干燥、70 ℃真空干燥及真空冷凍干燥后傘部、柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行GC-MS分析，經(jīng)80%以上相似度篩選，結(jié)果見表4。

表4 不同干燥條件下美味牛肝菌傘部、柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 The volatile flavor substances of pileuses and stipes of Boletus edulis Bull. under different drying conditions

續(xù) 表

由表4可知,通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)共鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)51種,其中醇類10種,醛類13種,酮類13種,酸類1種,酯類5種,含硫、含氮及雜環(huán)類化合物8種,烯類1種。對(duì)不同部位的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析后發(fā)現(xiàn),傘部共檢測(cè)出43 種化合物,其中醇類9種,醛類11種,酮類11種,酸類1種,酯類3種,含硫、含氮及雜環(huán)類化合物7種,烯類1種。柄部共檢測(cè)出40種化合物,其中醇類7種,醛類12種,酮類11種,酸類1種,酯類3種,含硫、含氮及雜環(huán)類化合物6種。

通過比較3種不同方法干燥的美味牛肝菌傘部及柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn),真空冷凍干燥方法無論是種類還是峰面積都是最好的,傘部有31種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為17.83×106;柄部有27種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為16.72×106。恒溫干燥法鑒定出傘部有26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為8.29×106;柄部有26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為13.90×106。真空恒溫干燥鑒定出傘部有22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為13.28×106;柄部有20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),峰面積為9.37×106。

2.3.1 醇類化合物

醇類化合物在新鮮食用菌中含量非常豐富, 但因其揮發(fā)性強(qiáng)、穩(wěn)定性差, 在加熱過程中會(huì)造成一定的損失[18]。3種不同干燥方法共鑒定出醇類化合物13種,其中傘部有11種,柄部有9種。真空冷凍干燥后鑒定出的醇類化合物有10種,恒溫干燥后鑒定出醇類化合物有8種,真空干燥后醇類化合物數(shù)量明顯減少,只有2種。峰面積最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇、橙花叔醇、苯乙醇、3-苯丙醇、正辛醇、1-壬醇、乙醇、正己醇、正戊醇。

2.3.2 醛類、酮類化合物

醛類、酮類是食用菌中較為豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),C5～C9醛類具有脂香氣味,酮類具有濃郁花果香氣[19-20]。3種不同干燥后的樣品共鑒定出醛類13種,酮類13種,其中70 ℃恒溫干燥后柄部醛類物質(zhì)最多,共11種,70 ℃真空干燥后傘部、柄部醛類物質(zhì)最少,均為7種。6種樣品中,異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、苯甲醛及苯乙醛是共有的醛類,其中異戊醛峰面積最大,其次是苯甲醛、苯乙醛、2-甲基丁醛和異丁醛。異戊醛存在于巧克力、可可、咖啡等食品中,廣泛用于食用香精的配方中[21-22]。

在檢測(cè)出的酮類化合物中,2,3-戊二酮和2-十一酮是共有的酮類,且以2-十一酮的峰面積最大。2,3-戊二酮是一種奶香型香料,廣泛用于食用香料的制備[23]。2-十一酮具有柑橘類、油脂和蕓香香氣,存在于云香草、椰子油和棕櫚油中[24]。

2.3.3 酸類、酯類化合物

酸類一般具有腥臭味,對(duì)風(fēng)味具有不良的影響[25],通過對(duì)3種不同方式干燥后的傘部和柄部都發(fā)現(xiàn)含有乙酸。酯類多具有水果和陳酒的香味,對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大[26]。真空冷凍干燥后的傘部有3種酯類,包括丙烯酸正丁酯、甲酸辛酯和異丁酸-3-苯基丙酯,70 ℃真空干燥柄部有3,7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯和亞油酸乙酯,其他干燥后的不同部位含酯類物質(zhì)很少。

2.3.4 其他

除了醇類、醛酮類、酸類及酯類化合物外,不同方式干燥后的美味牛肝菌中還鑒別出含硫化合物、含氮化合物、雜環(huán)類化合物及月桂烯等。含硫化合物包括甲硫醇、甲硫醚、3-甲硫基丙醛,含氮化合物包括2-乙酰基吡咯,雜環(huán)類化合物包括2-戊基呋喃、2-甲基四氫呋喃-3-酮、呋喃酮及異雪松醇。

2.3.5 八碳化合物和含硫化合物

八碳化合物是食用菌最重要的風(fēng)味物質(zhì),主要有1-辛烯-3-醇(蘑菇醇)、1-辛醇-3-酮、3-辛酮、3-辛醇及1-辛醇等[27]。由表4可知,不同方式干燥后美味牛肝菌傘部和柄部共檢測(cè)出的八碳化合物有7種,包括1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯-1-醇、正辛醇、1-辛烯-3-酮、3-辛酮、3-辛烯-2-酮、仲辛酮,其中醇類3種,酮類4種。峰面積最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇。Murahashi最早在1938 年發(fā)現(xiàn)了松茸(Tricholomamatsutake)中的1-辛烯-3-醇,并將其命名為松茸醇,目前,幾乎在所有的食用菌中都發(fā)現(xiàn)了1-辛烯-3-醇[28]。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、濕木頭、泥土的氣息[29],在真空冷凍干燥后傘部的相對(duì)含量最大,可達(dá)25.49%。反-2-辛烯-1-醇也具有蘑菇味[30],在真空冷凍干燥后的傘部、恒溫干燥后的柄部及真空干燥后的傘部被鑒定出來。

含硫化合物對(duì)食用菌整體的芳香氣味而言舉足輕重,并且是香菇中非常重要的香味來源。然而,關(guān)于不同干燥方式對(duì)美味牛肝菌不同部位含硫化合物的影響還未見報(bào)道。通過對(duì)干燥后美味牛肝菌不同部位進(jìn)行分析,共鑒定出3種含硫化合物,分別是甲硫醇、甲硫醚和3-甲硫基丙醛,其中以3-甲硫基丙醛的峰面積最大。3-甲硫基丙醛具有濃烈洋蔥、肉及烤馬鈴薯的香氣,低濃度時(shí)呈愉快的濃郁的肉香味,在香料工業(yè)中應(yīng)用十分普遍[31]。甲硫醇是重要的有機(jī)化工原料,也是我國允許使用的食用香料。

3 結(jié)語

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化得到美味牛肝菌中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件為萃取溫度79 ℃、萃取時(shí)間28 min、平衡時(shí)間23 min,在此條件下檢測(cè)出真空冷凍干燥后美味牛肝菌傘部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共31種,驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,利用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)萃取美味牛肝菌中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的方法可靠性高。對(duì)美味牛肝菌不同干燥方式處理后的傘部、柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),匹配度大于80的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共51種,其中醇類10種,醛類13種,酮類13種,酸類1種,酯類5種,含硫含氮及雜環(huán)類化合物8種,烯類1種。不同干燥方式對(duì)美味牛肝菌傘部、柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響也不同,就傘部而言,真空冷凍干燥后鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有31種,峰面積為17.83×106,均遠(yuǎn)高于70 ℃恒溫干燥(峰數(shù)26個(gè),峰面積8.29×106)和70 ℃真空干燥(峰數(shù)22個(gè),峰面積13.28×106)。對(duì)柄部而言,真空冷凍干燥后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有27種,峰面積為16.72×106,也高于70 ℃恒溫干燥(峰數(shù)26個(gè),峰面積13.90×106)和70 ℃真空干燥(峰數(shù)20個(gè),峰面積9.37×106)。總之,真空冷凍干燥處理能夠較好保存美味牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。云南有豐富的美味牛肝菌資源和廣闊的消費(fèi)市場(chǎng),后期試驗(yàn)還需進(jìn)一步研究其他干燥方式及干燥條件對(duì)美味牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,通過對(duì)比分析以期獲得美味牛肝菌更為經(jīng)濟(jì)適用的干燥方式。

綜上所述,不同干制方法下美味牛肝菌傘部、柄部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量有著較大的差異,也代表著不同的食品風(fēng)味。以營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的美味牛肝菌為原料,采用不同干制方法制備的調(diào)味料及復(fù)合調(diào)味料也一定會(huì)成為食用菌調(diào)味料的研發(fā)熱點(diǎn),有著廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。