葛根素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕壓力負(fù)荷引起小鼠心肌肥厚實(shí)驗(yàn)研究

劉艷麗，董文婷，尚福軍，馮海濤，郭 錦，王 錦

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院，陜西 西安 710100;2.西安市臨潼區(qū)婦幼保健院，陜西 西安710600)

心肌肥厚是心臟受到各種刺激時(shí)，為了維持心輸出量，出現(xiàn)的一種適應(yīng)性和代償性反應(yīng)[1]。由于成熟心肌細(xì)胞已經(jīng)成為一種終末分化細(xì)胞，幾乎喪失分裂和增殖能力，只能通過肥厚性重塑改變其體積和重量以增加心肌收縮力[2]。然而，長期的慢性刺激如高血壓會(huì)導(dǎo)致心臟失代償而進(jìn)展為病理性心肌肥厚，并最終導(dǎo)致心臟功能障礙和心力衰竭。臨床研究[3-4]表明，心肌肥厚是觸發(fā)心力衰竭發(fā)生不良后果和心血管死亡事件增加的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病、缺血性心臟病甚至猝死。心肌肥厚是一個(gè)非常復(fù)雜的病理重塑過程，伴有心肌纖維化、細(xì)胞凋亡和心臟功能障礙[5-6]。然而，臨床上缺乏防治病理性心肌肥厚的藥物。葛根素(Puerarin,Pue)是黃酮類化合物，化學(xué)名為7,4’-二羥基異黃酮-8β-吡喃葡萄糖苷，是從中藥葛根中提取的主要活性成分[7]。葛根素的藥理作用包括改善微循環(huán)、降低炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、清除氧自由基和改善胰島素抵抗，使其成為治療高血壓、腦缺血、心肌缺血、糖尿病和動(dòng)脈硬化的潛在藥物[8-9]。但是Pue能否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)心肌肥厚尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)將通過腹主動(dòng)脈縮窄(Abdominal aortic constriction，AAC)方法建立心肌肥厚動(dòng)物模型，觀察Pue灌胃給藥4周后對壓力負(fù)荷引起的心肌肥大及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 在西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買60只8周齡成年雄性C57/bl小鼠；Pue(P5555)購買于Sigma公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FP209)購于天根生化科技(北京)有限公司；PERK(3192S)、CHOP(2895S)和GRP78(3183S)抗體均購自Cell Siginal Technology公司；GAPDH(60004-1-Ig)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠(PR30012)和山羊抗兔(PR30011)二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 心肌肥厚模型的制備 待雄性C57/bl小鼠麻醉后，將小鼠固定于小動(dòng)物手術(shù)操作臺上，行氣管插管并連接呼吸機(jī)，采用AAC引起心肌肥厚。方法如下：無菌條件下通過腹部中線切口暴露腹主動(dòng)脈，并沿腹主動(dòng)脈放置一根18號針。在腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈上方的針頭周圍緊密地綁著一條結(jié)扎線(7-0絲線)。隨后取下針頭，形成縮窄區(qū)。假手術(shù)組小鼠手術(shù)操作與模型組相同，但不結(jié)扎腹主動(dòng)脈。手術(shù)完成后，逐層縫合，并將小鼠放在暖墊上，待到它們從麻醉中恢復(fù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 60只小鼠隨機(jī)分成四組(n=15)：假手術(shù)組(Sham組)；Pue對照組(Pue組)；腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)組(AAC組)；Pue干預(yù)AAC組(Pue+AAC組)。根據(jù)以往文獻(xiàn)[10]報(bào)道，Pue組和Pue+AAC組術(shù)后腹腔注射50 mg/(kg·d) Pue，持續(xù)4周，Sham組和AAC組腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)4周，所有小鼠均采用正常飲食，可自由攝取水和食物。

1.4 小動(dòng)物超聲檢測心臟功能 采用小動(dòng)物超聲儀檢測心臟功能，AAC術(shù)后4周，小鼠麻醉后采用脫毛膏去除胸前區(qū)被毛，用VEVO 770小動(dòng)物超聲儀檢測左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall thickness,LVPWd)、左室內(nèi)徑(Left ventricular diameter,LVId)和室間隔厚度(Interventricular septal depth,IVSd)。

1.5 RT-PCR檢測ANP和Myh7 mRNA水平 根據(jù)RNA提取試劑盒步驟提取心臟組織總RNA，采用分光光度儀檢測RNA濃度，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA；配制總體積為20 μl的反應(yīng)體系，其中包括：cDNA 2 μl、超純水7.4 μl、引物0.8 μl和SYBR Green Mix 9 μl。擴(kuò)增程序設(shè)為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共38個(gè)循環(huán)。計(jì)算Ct值、2-ΔΔCt值。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.6 心臟重量與體重比值 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉稱重并記錄每只小鼠體重(Body weight,BW)，然后通過頸動(dòng)脈放血將小鼠處死，快速開胸取下心臟并稱重，記錄心臟重量(Heart weight,HW)，計(jì)算心臟重量/體重比值(HW/BW)。

1.7 Masson染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉，快速開胸取出心臟，在預(yù)冷的PBS中沖洗，然后放入4%多聚甲醛中固定，行常規(guī)二甲苯和梯度乙醇脫水，石蠟包埋，并切成3 μm厚的薄片。行常規(guī)Masson染色方法步驟，染好后用中性樹脂封片，在普通光學(xué)顯微鏡下拍照，Image J軟件計(jì)算纖維化面積比例。

1.8 Western blot檢測PERK、GRP78和CHOP蛋白的表達(dá) 常規(guī)方法提取心臟組織蛋白，BCA法定量蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，每孔蛋白樣品上樣量相同，恒壓90 V電泳100 min，濕轉(zhuǎn)法恒流200 mA轉(zhuǎn)膜90 min；將轉(zhuǎn)好的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min；根據(jù)分子量大小將目的條帶切下分別放入PERK(1∶1000)、GRP78(1∶1000)、CHOP(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)抗體管4 ℃搖床孵育12 h；TBST洗膜3次，10 min/次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5000)和山羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫?fù)u床孵育120 min，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL顯色，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 Pue改善AAC引起的心臟室壁厚度增加 見圖1。和Sham組比較，Pue組LVPWd、IVSd和LVId值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；和Sham組比較，AAC組LVPWd和IVSd值增加，LVId降低(均P<0.01)；和AAC組比較，AAC+Pue組LVPWd和IVSd值降低，LVId增加(均P<0.01)。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AAC組比較，#P<0.01

2.2 Pue抑制AAC引起的HW/BW值、ANP和Myh7 mRNA水平增加 見圖2。和Sham組比較，Pue組HW/BW值、ANP和Myh7 mRNA水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；和Sham組比較，AAC組HW/BW值、ANP和Myh7 mRNA水平增加(均P<0.01)；和AAC組比較，AAC+Pue組HW/BW值、ANP和Myh7 mRNA水平降低(均P<0.01)。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AAC組比較，#P<0.01

2.3 Pue抑制AAC引起的心肌細(xì)胞增大 見圖3。WGA染色結(jié)果顯示Sham組和Pue組心肌細(xì)胞橫截面積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；和Sham組比較，AAC組心肌細(xì)胞橫截面積明顯增加，和AAC組比較，AAC+Pue組心肌細(xì)胞橫截面積減小(均P<0.01)。

2.4 Pue抑制AAC引起的心肌纖維化 見圖4。Masson染色結(jié)果顯示Sham組和Pue組心肌纖維化程度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)；和Sham組比較，AAC組心肌纖維化程度明顯增加(P<0.01)；和AAC組比較，AAC+Pue組心肌纖維化程度降低(P<0.01)。

2.5 Pue抑制AAC引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 見圖5。和Sham組比較，Pue組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK、GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；和Sham組比較，AAC組PERK和CHOP蛋白表達(dá)明顯增加，GRP78表達(dá)降低(均P<0.01)；和AAC組比較，AAC+Pue組AAC組PERK和CHOP蛋白表達(dá)明顯減少，GRP78表達(dá)增加(均P<0.01)。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AAC組比較，#P<0.01

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AAC組比較，#P<0.01

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AAC組比較，#P<0.01

3 討 論

心肌肥厚是心臟對生理或病理性刺激的一種代償性反應(yīng)機(jī)制，成年心肌細(xì)胞沒有增殖能力，只能通過單個(gè)細(xì)胞面積和體積增大，增加心室肌壁厚度和質(zhì)量，進(jìn)而維持心肌收縮力、心輸出量和全身循環(huán)血量的需求[10]。心肌肥厚涉及多種復(fù)雜的機(jī)制，包括血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)體液激素激活、生長因子/細(xì)胞因子、缺氧、衰老和糖尿病等一系列的變化，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞質(zhì)量增加、肌節(jié)重排和心肌間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。流行病學(xué)研究表明，心肌肥厚是心血管病發(fā)病和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。闡明心肌肥厚的病理機(jī)制并尋找潛在的防治方法成為研究的重要方向。

Pue作為傳統(tǒng)中藥葛根中提取的主要生物活性成分，在心血管疾病如缺血再灌注、心肌梗死、糖尿病心肌病和動(dòng)脈粥樣硬化等方面均具有較好的治療效果，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡、降低氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)有關(guān)[12-14]。Pue在心肌肥厚中的作用也得到了廣泛關(guān)注，有研究報(bào)道，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中，Pue可通過上調(diào)miR-15b/195抑制TGF-β信號通路減輕心肌肥厚[15]；Pue還能激活Nrf2并調(diào)控ROS含量，抑制氧化應(yīng)激損傷和心肌肥厚[16]；此外Pue還可以通過激活Sirt1信號改善心肌缺血再灌注損傷[8]，但Pue在AAC引起的心肌肥厚中的作用和機(jī)制還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Pue干預(yù)AAC能明顯減小LVPWd和IVSd值，增加LVId，Pue可以降低AAC引起的HW/BW值、ANP和Myh7 mRNA水平增加；心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞橫截面積增大、細(xì)胞外基質(zhì)重塑引起心肌纖維化加重。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AAC引起的心肌肥厚中心肌細(xì)胞橫截面積和纖維化明顯增加，而Pue干預(yù)AAC可明顯降低心肌細(xì)胞橫截面積和纖維化，這些結(jié)果表明，Pue能夠改善AAC引起的心肌肥厚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控以及脂質(zhì)合成中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-19]。在某些病理因素的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)的積累，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過影響轉(zhuǎn)錄和翻譯，激活未折疊蛋白反應(yīng)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)態(tài)。然而，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與各種心臟病的發(fā)展和進(jìn)展，如心肌肥大、缺血性心臟病和心力衰竭[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AAC明顯增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK和CHOP的表達(dá)，降低GRP78表達(dá)；而Pue干預(yù)AAC后抑制PERK和CHOP的表達(dá)，增加GRP78的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，Pue能通過抑制心肌纖維化改善AAC引起的心肌肥厚，其作用機(jī)制與減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。這些結(jié)果為臨床上進(jìn)一步探討Pue治療心肌肥厚提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，這項(xiàng)研究仍存在一定的不足，由于只觀察了心肌肥厚時(shí)Pue對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，而沒有探討Pue如何調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因此，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步闡明Pue調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路。