右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡與Toll樣受體4/核因子κB信號通路的影響

雍 芳，狄政莉，賈曉濤，劉志勤，顧乃兵，郝敏鋒，燕玉娥

(西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710004)

癲癇是臨床常見的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由于腦神經(jīng)元異常和過度超同步化放電引起的大腦功能暫時性障礙性疾病[1-2]。癲癇發(fā)作能夠造成大腦缺氧，長期反復發(fā)作癲癇可造成患者認知功能、記憶功能嚴重降低[3-4]。目前認為癲癇引起的認知和記憶功能減退與神經(jīng)元細胞凋亡、氧化應激、炎性反應等因素有關[5]。右美托咪定是一種α2腎上腺能受體激動劑，目前被廣泛應用于各種手術和侵入式檢查中，發(fā)揮鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用[6]。有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定具有良好的抗炎作用和器官保護作用，能夠減輕心肌缺血-再灌注、肺缺血-再灌注損傷程度，減少相關細胞凋亡，對神經(jīng)元有一定保護作用。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR-4)/核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路能夠調(diào)節(jié)多種炎性因子和細胞凋亡相關因子表達[9]。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射制作大鼠癲癇模型，觀察右美托咪定預處理對癲癇模型大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡和TLR-4/NF-κB信號通路表達的影響，以期探討右美托咪定在癲癇預防中的效果和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇45只健康雄性SPF級SD大鼠，10～15周齡，平均(12.7±2.1)周齡，體重235～259 g，平均(245.5±9.6)g，均購自川北醫(yī)學院，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2018-18。試驗開始前適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對濕度40%～70%，自然晝夜，分籠進行喂養(yǎng)，每籠5只，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。保持環(huán)境清潔、整潔。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑：鹽酸右美托咪定注射液(國藥準字H20130093)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；蛋白質(zhì)Marker購自New England Biolabs公司；兔抗大鼠NF-κB、磷酸化NF-κB(pNF-κB)、離子鈣結合銜接分子1(Iba-1)、Toll樣受體4(TLR-4)和β-actin單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜購自德國Millipore公司。

1.2.2 主要儀器：RT-6100 型酶標儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；垂直電泳儀、Chemi DOC XRS凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 分組及給藥:采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為A組、B組和C組，各15只。適應飼養(yǎng)1周后給予C組大鼠腹腔注射20 μg/kg右美托咪定，給予A組和B組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)腹腔注射7 d。

1.3.2 動物模型建立:給藥7 d后采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射法[4]建立癲癇大鼠模型。B、C組在大鼠清醒狀態(tài)下給予腹腔注射127 mg/kg氯化鋰溶液，18～22 h后給予腹腔注射1 mg/kg，30 min后給予腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品。觀察大鼠行為表現(xiàn)并進行Racine分級，反復Racine分級評價為Ⅳ級以上視為癲癇持續(xù)發(fā)作，若持續(xù)1 h以上則視為造模成功。若大鼠在注射匹羅卡品后30 min未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，則每間隔10 min追加腹腔注射10 mg/kg匹羅卡品直至造模成功。一旦成功造模，立即腹腔注射10 mg/kg地西泮終止癲癇發(fā)作，若注射后15 min仍未能終止則追加腹腔注射10 mg/kg地西泮。A組大鼠予以注射等體積0.9%氯化鈉溶液注射。

1.3.3 Morris水迷宮測試:建模成功飼養(yǎng)1周后進行Morris水迷宮測試。池內(nèi)水溫保持在22～26 ℃，加入少量奶粉形成濁液以混淆大鼠視線。將水池等分為4個象限，任意選定一個象限放置平臺(直徑15 cm，位于水下約2 cm)，實驗前1 d將大鼠放入水迷宮中進行適應。①定位航行試驗：為期5 d，將大鼠面向池壁分別從2個入水點放進水中，記錄大鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在2 min內(nèi)沒有找到平臺，將逃避潛伏期記為120 s;②空間探索試驗：第6天時撤去平臺，將大鼠從任意一個入水點放入水中，記錄60 s時間內(nèi)大鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平:斷頭法處死大鼠，立即取腦組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗血跡，取少量海馬組織準確稱重，冰上制備海馬組織勻漿，12 000 r/min離心10 min后分離上清液，檢測其中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，所有樣本均進行3次重復檢測，以平均值作為最終結果。

1.3.5 海馬神經(jīng)元細胞凋亡檢測:取海馬組織經(jīng)蛋白酶K消化處理1 h，磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)連續(xù)漂洗3次，每次5 min，經(jīng)TUNEL染色后棕黃色或棕褐色為凋亡細胞，于200×倍下計數(shù)凋亡細胞數(shù)量，計算視野內(nèi)凋亡細胞所占比例。

1.3.6 Western blot檢測海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白表達:取50～100 mg海馬組織準確稱重后放入EP管中，加入RIPA裂解液在4 ℃充分勻漿，4 ℃下12 000 g離心10 min后留取上清液備用。采用BCA試劑盒檢測上清液總蛋白濃度。根據(jù)總蛋白濃度取適量上清液進行SDS-PAGE電泳，80 V電泳40 min后轉(zhuǎn)為110 V繼續(xù)電泳70 min，電泳結束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，按照目標蛋白分子量大小切取條帶，分別加入NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4一抗，2 ℃過夜孵育。5%脫脂奶粉封閉1 h后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色并曝光。采用Image J圖像分析系統(tǒng)，以管家基因蛋白β-actin作為參比計算相對吸光度值。

2 結 果

2.1 三組大鼠造模后逃避潛伏期和平臺穿越次數(shù)比較 三組大鼠第1～5 天的逃避潛伏期均呈現(xiàn)顯著降低趨勢(均P<0.05)。C組各時間點逃避潛伏期長于A組，短于B組(均P<0.05)。C組大鼠平臺穿越次數(shù)少于A組，多于B組(均P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠逃避潛伏期和平臺穿越次數(shù)比較

2.2 三組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較 三組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。B組和C組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著高于A組，C組大鼠各指標顯著低于B組(均P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較(pg/mg)

2.3 三組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡比例比較 C組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡比例顯著高于A組，但顯著低于B組(均P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡比例比較(%)

2.4 三組大鼠海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較 三組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，NF-κB蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平顯著高于A組，但顯著低于B組(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較

3 討 論

在我國，癲癇已經(jīng)成為僅次于腦血管疾病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計我國現(xiàn)有癲癇患者約900萬，人群總發(fā)病率高達7‰，每年新增癲癇發(fā)病病例高達22.39～22.8/10萬[10-11]。癲癇發(fā)病和發(fā)作機制目前尚未完全清楚，但通過腦電圖檢查可以發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者腦部神經(jīng)存在異常生物放電現(xiàn)象。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立癲癇大鼠模型，該種模型與人類癲癇臨床表現(xiàn)和機制相似度高，均可見神經(jīng)元細胞損傷和凋亡，膠質(zhì)細胞增生、激活等病理變化。本研究在建模后1周對各組大鼠進行Morris水迷宮測試，結果表明，C組各時間點逃避潛伏期顯著長于A組，但顯著短于B組，C組大鼠平臺穿越次數(shù)顯著少于A組，但多于B組。提示相較于正常大鼠，模型大鼠均表現(xiàn)出認知功能和記憶功能減退，經(jīng)右美托咪定預處理能夠顯著改善認知和記憶功能。

炎性反應是癲癇患者認知功能損傷發(fā)生的重要病理和生理基礎，目前研究均發(fā)現(xiàn)當發(fā)生癲癇后，機體外周血促炎細胞因子和炎性介質(zhì)表達迅速增加，加重神經(jīng)損傷程度[12-13]。在造模前給予右美托咪定能夠顯著降低造模后海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平。右美托咪定能夠高特異性地結合中樞神經(jīng)突觸前膜α2腎上腺能受體抑制去甲腎上腺素(NE)釋放，進而減輕手術引起的應激、損傷，保持血流動力學穩(wěn)定，右美托咪定具有良好的抗炎和抗氧化作用[14-15]，而癲癇發(fā)作損傷認知和記憶功能的可能機制就包括氧化應激、炎癥因子的作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)右美托咪定對肝、腎等多個重要臟器損傷具有明顯的保護作用。

癲癇發(fā)作后炎癥因子的表達和釋放與海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞活化密切相關，癲癇發(fā)作可刺激小膠質(zhì)細胞活化，啟動TLR-4/NF-κB信號通路，繼而快速表達和釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子[16-17]。TLR-4是機體監(jiān)視和識別病原體相關分子模式并啟動天然免疫反應的重要分子，研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后，小膠質(zhì)細胞內(nèi)的病原體識別受體釋放并被TLR-4識別，激活TLR-4/NF-κB信號通路，并通過級聯(lián)放大效應引起炎癥因子的釋放[18]。本研究采用Western blot技術檢測了三組大鼠海馬組織中TLR-4/NF-κB信號通路中關鍵蛋白的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)三組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較有統(tǒng)計學差異，NF-κB蛋白相對表達水平無統(tǒng)計學差異。C組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平顯著高于A組，但顯著低于B組。pNF-κB是NF-κB的磷酸化形式，也是其活化的標志，TLR-4能夠增強NF-κB磷酸化[19]。Iba-1是小膠質(zhì)細胞活化的標志物[20]。本研究結果提示癲癇發(fā)作引起TLR-4表達上調(diào)，促進NF-κB磷酸化，pNF-κB表達上調(diào)，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化，進而引起神經(jīng)炎癥損害和細胞凋亡。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，C組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡比例顯著高于A組，但顯著低于B組，提示右美托咪定能夠通過抑制TLR-4表達和NF-κB磷酸化，減少星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化引起的炎性因子表達和釋放，減輕神經(jīng)炎性損傷，減少海馬神經(jīng)元細胞凋亡。

綜上，右美托咪定不僅可以通過激活TLR-4/NF-κB信號通路抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的炎性反應，還可以通過激活TLR-4/NF-κB信號通路下調(diào)炎癥因子表達進而抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細胞的凋亡，從而改善神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。