紫草素誘導(dǎo)慢性髓系白血病細(xì)胞增殖抑制和凋亡的PTEN信號通路研究

吳晉周，靳建旭

(西安市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，陜西 西安 710021)

細(xì)胞凋亡在包括癌癥在內(nèi)的疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[1]。腫瘤細(xì)胞不易發(fā)生凋亡，因為它們激活細(xì)胞凋亡信號通路的能力有缺陷。因此，激活腫瘤細(xì)胞凋亡途徑是一種有效的腫瘤治療方法[2]。慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一種與造血組織相關(guān)的腫瘤。目前主要以放療、化療和干細(xì)胞移植等治療方式為主[3]。目前，CML患者的預(yù)后仍然很差，存活率不高[4]。植物、微生物和海洋生物在內(nèi)的自然產(chǎn)物為發(fā)現(xiàn)抗癌藥物提供了豐富的資源。紫草是一種傳統(tǒng)中草藥，可分離出如苯酮類、生物堿類和苯酚類的多種化合物[5]。紫草素是一種萘醌類化合物，主要提取于紫草的根，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，對細(xì)胞的生長也有影響，如能誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[6-8]。本研究以人CML細(xì)胞K562為靶細(xì)胞，以紫草素為誘導(dǎo)劑，研究紫草素對K562細(xì)胞的分子作用機制，為抗癌藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 K562細(xì)胞(武漢病毒研究所)；健康個體外周血淋巴細(xì)胞(重慶巴爾思細(xì)胞庫)；紫草素(中國藥品與生物制品檢定所)；MTT試劑盒(美國BD公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；兔抗人PTEN、p-PI3K多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鏈霉素、青霉素(上海捷瑞生物工程有限公司)；鼠抗人p-Akt單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；細(xì)胞培養(yǎng)液PRMI 1640(美國，Gibgo公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物試劑公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含有10%胎牛血清，100 U/ml的鏈霉素和青霉素的PRMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)K562細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2.2 實驗分組：配制濃度為1 mmol/L的紫草素培養(yǎng)液，然后過濾除菌。將1 mmol/L的培養(yǎng)液稀釋為不同濃度的溶液，分別為10、20、30、40、50 μmol/L。細(xì)胞分組為對照組(0 μmol/L紫草素)和紫草素10 μmol/L組、紫草素30 μmol/L組、紫草素50 μmol/L組。

1.2.3 MTT法檢測K562細(xì)胞增殖和正常細(xì)胞的存活率：以每孔1×105/ml細(xì)胞數(shù)將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔加入不同濃度的紫草素，然后每個組設(shè)置6個復(fù)孔，空白對照為不加入紫草素。將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，培養(yǎng)時間分別為12、24、48、72 h。預(yù)定時間前4 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后離心棄上清液，再加入DMSO,每孔加入150 μl，震蕩混勻使每個孔中的晶體能夠完全溶解。使用酶標(biāo)儀于波長570 nm處讀取吸光度(A)值，并根據(jù)以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞存活率。增殖抑制率=(1-藥物處理組吸光度值/無藥物處理組吸光度值)×100%,正常細(xì)胞存活率=(藥物處理組吸光度值/無藥物處理組吸光度值)×100%。使用健康個體外周血淋巴細(xì)胞檢測正常細(xì)胞存活率，實驗步驟同MTT實驗。

1.2.4 Annexin V雙染法檢測K562細(xì)胞凋亡：以1×105/ml將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板內(nèi)。在培養(yǎng)24 h后，加入稀釋后的不同濃度(10、20、30、40、50 μg/ml)的紫草素溶液，在未加入紫草素溶液的孔中加入等體積的DMSO。將1 ml細(xì)胞懸浮液1000 r/min離心5 min，去上清，再加入RNase，于37 ℃水浴中孵育1 h。然后加入0.5 mg/L碘化丙啶(PI)和Annexin V，放置于冰上，孵育結(jié)束后，再使用流式細(xì)胞術(shù)檢測。再利用CELIQUEST軟件來分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察：將培養(yǎng)72 h后K562的細(xì)胞進(jìn)行處理，將細(xì)胞分為兩部分，一部分進(jìn)行細(xì)胞涂片，待涂片晾干后使用常規(guī)Wright-Gimsa染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；另外一部分細(xì)胞制作成切片，使用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)：以5×105個/ml的細(xì)胞數(shù)將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行細(xì)胞蛋白的提取。獲得蛋白后使用BCA法定量蛋白，然后進(jìn)行Western blot檢測實驗。使用內(nèi)參β-actin為對照，根據(jù)條帶灰度值判斷蛋白相對表達(dá)量，蛋白相對表達(dá)量使用目的蛋白灰度值與β-actin比值來表示。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素對K562細(xì)胞增殖抑制率的影響 見圖1。MTT檢測結(jié)果顯示，在紫草素濃度為10 μmol/L時，在各個時間觀察點(12、24、48、72 h)，紫草素對K562細(xì)胞存活率影響較小，但隨著紫草素濃度的增加，對K562細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增加；相同濃度的紫草素，隨著作用時間的增加，對K562細(xì)胞抑制作用顯著增加，K562細(xì)胞存活率顯著降低；紫草素作用時間72 h時，隨著紫草素濃度增加，對K562細(xì)胞存活率呈現(xiàn)顯著抑制作用，但當(dāng)濃度超過30 μmol/L并繼續(xù)增加，紫草素對K562細(xì)胞存活率影響不再發(fā)生明顯變化。所以紫草素的最佳作用濃度為30 μmol/L，最佳作用時間為72 h。實驗結(jié)果顯示紫草素呈濃度依賴性抑制K562細(xì)胞增殖，同時，隨著作用時間的增加，抑制效果逐漸增強。

圖1 紫草素對K562細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 紫草素對正常細(xì)胞存活率的影響 見圖2。隨著紫草素濃度的增高，健康人外周血淋巴細(xì)胞的存活率逐漸降低，說明紫草素濃度的增高，細(xì)胞毒性增強。當(dāng)紫草素濃度為30 μmol/L時，72 h的細(xì)胞存活率為(90.23±2.50)%，紫草素對外周血淋巴細(xì)胞存活率的影響較小。控制紫草素濃度，可以較好的控制紫草素對健康個體外周血淋巴細(xì)胞毒性。

圖2 紫草素對健康個體外周血淋巴細(xì)胞存活率的影響

2.3 紫草素對K562細(xì)胞凋亡的影響 見表1。用不同濃度(10、20、30、40、50 μmol/L)的紫草素作用于K562細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例，K562細(xì)胞的相對生存率隨著紫草素濃度的增高而降低(均P<0.05)，這說明紫草素的抑制作用具有濃度依賴性。與0 μmol/L組相比，早期和晚期凋亡率增加明顯，這表明紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用也具有濃度依賴性。

表1 不同濃度紫草素作用24 h對K562細(xì)胞凋亡率的影響(%)

2.4 紫草素對K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 在對照條件下，未經(jīng)處理的K562細(xì)胞生長良好，骨骼清晰、細(xì)胞呈圓形、核仁明顯(圖3A)；紫草素處理72 h后(圖3B)，通過光鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積縮小、胞膜起泡的現(xiàn)象；進(jìn)行Wright-Giemsa染色后,觀察到細(xì)胞的染色質(zhì)濃聚，核裂解及典型的凋亡小體等現(xiàn)象；與未處理的K562相比(圖3C)，在電鏡下觀察到包括細(xì)胞濃縮、染色質(zhì)邊緣化和空泡化等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征(圖3D)。

2.5 紫草素對K562細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)的影響 見表2。與對照組相比，實驗組的PTEN的蛋白表達(dá)量明顯增高，而p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)，同時，紫草素對蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用具有濃度差異(均P<0.05)。

A:未經(jīng)紫草素處理的K562細(xì)胞(Wright-Gimsa染色，×100)；B：紫草素處理的K562細(xì)胞(Wright-Gimsa染色，×100);C：未經(jīng)紫草素處理的K562細(xì)胞(透射電子顯微鏡，×5000)；D：紫草素處理的K562細(xì)胞(透射電子顯微鏡，×5000)

表2 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)比較

3 討 論

正常的骨髓產(chǎn)生攜帶氧氣的紅細(xì)胞、保護(hù)身體不受感染的白細(xì)胞和參與血液凝結(jié)的血小板[9]。在CML中，骨髓產(chǎn)生過多的白細(xì)胞[10-11]，最初，這些細(xì)胞的功能相對正常。然而，隨著病情的發(fā)展，被稱為成髓細(xì)胞(或母細(xì)胞)的未成熟白細(xì)胞在血液和骨髓中積累。成髓細(xì)胞的過度生長會損害其他血細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致紅細(xì)胞(貧血)和血小板的缺乏。CML通常發(fā)生在60歲以后，常見的癥狀包括過度疲勞、發(fā)熱和體重減輕，許多受影響的人會出現(xiàn)脾臟腫大，這可能導(dǎo)致腹部飽腹感和食欲不振。另外，大約一半的CML患者最初沒有任何體征和癥狀，由于其他原因進(jìn)行血液檢查時才被診斷出來。

研究發(fā)現(xiàn)，許多天然化學(xué)物質(zhì)已能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如白芍、蛇床子、人參皂苷、大黃素和姜黃素等均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。紫草素通過抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。紫草素的主要成分為萘醌類化合物，可對人宮頸癌Hela細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞株CCL229、人胃癌BGC823細(xì)胞等起抑制作用[14-16]。紫草素是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶如v-Src和EGFR的非競爭性ATP抑制劑，抑制了腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1(Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1)基因的表達(dá)，TRAP1產(chǎn)生可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系的凋亡。李運曼等[17]通過研究紫草素誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌COLO 205細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞溶膠中，能夠使Caspase-9和Caspase-3特異性的激活產(chǎn)生聯(lián)結(jié)反應(yīng)，誘使細(xì)胞凋亡。Caspase-3的激活，誘導(dǎo)PARP和DFF-45的裂解和核酸內(nèi)切酶的激活。

本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素對K562細(xì)胞生長的抑制作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。同時，紫草素對健康人外周血淋巴細(xì)胞存活率的影響表明紫草素具有一定的細(xì)胞毒性作用。控制紫草素的濃度為30 μmol/L，作用時間72 h，紫草素的增殖抑制率效果最佳。形態(tài)學(xué)上看，紫草素處理后，通過顯微鏡觀察到細(xì)胞的收縮和凋亡體，然后通過熒光染色實驗證實了前面的細(xì)胞凋亡結(jié)論。部分細(xì)胞經(jīng)鏈烷單寧處理后染色體聚集和質(zhì)膜泡狀，同時可見細(xì)胞核斷裂，致密的細(xì)胞核可以得出結(jié)論，與正常細(xì)胞相比發(fā)生了凋亡的細(xì)胞死亡。以上實驗結(jié)果表明，紫草素能夠抑制慢性髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞的生長。

PTEN是一個腫瘤抑制基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑制基因，PTEN的缺失廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中，是腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)后因素[18]。過表達(dá)PTEN是治療胃癌的潛在策略。PTEN能負(fù)調(diào)控Akt信號通路，失活A(yù)kt信號通路會抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲[19]。研究[20-21]表明，在腫瘤組織中PTEN表達(dá)升高會加強負(fù)調(diào)控Akt信號通路，使p-Akt降低，從而抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。Choi等[22]、Pan等[23]發(fā)現(xiàn)PTEN抑癌基因的表達(dá)能使3-原肌醇環(huán)上的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)產(chǎn)物去磷酸化，導(dǎo)致磷酸磷脂酰肌醇(PI)的生成，從而降低Akt的活化，Akt是一種細(xì)胞存活蛋白激酶，通過多種下游效應(yīng)器介導(dǎo)其活性，導(dǎo)致細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡抑制。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，毛鉤藤堿能夠通過上調(diào)肺癌細(xì)胞A549中PTEN的表達(dá)從而抑制Akt通路的激活，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖或凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能上調(diào)細(xì)胞PTEN的蛋白表達(dá)量，下調(diào)p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)量,抑制K562細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，紫草素對K562細(xì)胞內(nèi)PTEN/PI3K/Akt通路的活性具有良好的調(diào)控效果。