基于質譜技術的早產兒視網膜病血代謝產物的初步研究

楊秋萍 李思濤 郝虎, 古霞 石聰聰 肖昕, 蔡堯

（1.中山大學附屬第六醫院兒科，廣東廣州 510655；2.中山大學附屬第六醫院小兒遺傳代謝病實驗室，廣東廣州 510655）

早產兒視網膜病（retinopathy of prematurity，ROP）是發生于早產及低出生體重兒的視網膜血管增生性疾病，是嬰幼兒最常見的致盲和致低視力眼病［1］。隨著醫學的發展和早產兒救治水平的提高，早產兒、低出生體重兒的存活率不斷提升，ROP發病率也逐年上升。目前我國主要采用眼底數碼相機或者間接眼底鏡和透鏡結合的方式進行ROP篩查，為了早期發現和及時治療，降低ROP導致的視力障礙等相關后遺癥，早期預測和診斷尤其重要。代謝組學是對生物體代謝組分的定性和定量分析，直觀呈現生物體的代謝譜，靈敏地反映生物體在疾病發生、發展過程中的代謝產物變化［2］。Nivison-Smith等［3］發現氨基酸代謝與視網膜發育、視網膜疾病（尤其是發育過程中發生的）密切相關。氨基酸代謝影響了視網膜血管發育和張力、氧化還原反應狀態、免疫及炎癥等功能［4］。代謝組學用于識別與疾病相關的代謝物質變化，代謝干預有利于疾病的預防，提供尋找新治療靶點的機會。目前ROP患兒與代謝相關的研究有限，ROP疾病中受影響的代謝物或途徑尚不明確。本研究采用液相色譜-串聯質譜技術與代謝組學分析方法對ROP患兒和非ROP患兒血代謝產物進行回顧性分析，旨在探究ROP患兒特異性代謝標志物，為ROP的早期識別與診斷、治療提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取2013年1月—2016年12月中山大學附屬第六醫院住院的早產兒作為研究對象，記錄其出生時胎齡、體重、身長、呼吸支持方式、吸氧時間、是否患新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS） 等指標情況。所有早產兒腸內及腸外營養均參考《中國新生兒營養支持臨床應用指南》［5］。

納入標準：（1）早產兒，胎齡27~34周，適于胎齡兒，病程中診斷ROP的患兒為ROP組，未診斷ROP患兒為非ROP組；（2）早產兒母親無高血壓、糖尿病、腎臟疾病等慢性疾病，無妊娠合并癥，無吸煙、酗酒、吸毒或藥物濫用史。排除標準：患兒有顱內出血、缺血缺氧性腦病、新生兒壞死性小腸結腸炎、先天性發育畸形、染色體異常、遺傳代謝性疾病等嚴重疾病或者死亡。

1.2 ROP診斷標準

運用間接眼底鏡和屈光度為25 D或28 D的透光鏡進行視網膜檢查，觀察到視網膜血管分界處增生性病變、血管走行異常及不同程度的牽拉性視網膜脫離，則診斷ROP［6］。本研究獲得中山大學附屬第六醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：2018ZSLYEC-114），研究對象監護人均知情同意。

1.3 標本采集

新生兒出生24 h內，留取足跟血3滴，浸透于專用濾紙片上，每個血滴>0.8 cm，于室溫自然干燥后1周內在我院遺傳代謝病實驗室進行血代謝物檢測。

1.4 儀器和試劑

高效液相儀（日本島津公司）、串聯質譜儀（API 3200 QTRAP，美國生物應用系統公司）、96微孔板氮吹儀（北京眾益中和生物技術有限公司）、96孔板離心機（上海白洋）、臺式高速離心機（德國Hittech公司）。新生兒血片采集卡（美國Whatman903號濾紙）、96孔過濾板（0.45 μm，美國Millipore公司），96孔聚丙烯微孔板（美國Fisher公司）、酰基肉堿同位素內標（美國Cambridge Isotope Labs公司）、甲醇及乙腈（美國Sigma公司）。

1.5 樣本處理及檢測

用打孔器截取直徑5 mm血片，置于96孔微量過濾板中，每孔加入100 μL同位素內標使用液（甲醇稀釋內標儲備液至100倍），室溫放置20 min，3 000 r/min離心5 min，轉移至96孔聚丙烯微孔板中，50℃吹干后加入60 μL鹽酸正丁醇（3 mol/L），聚四氟乙烯膜覆蓋，置于65℃恒溫箱15 min，然后50℃吹干，加入80%乙腈100 μL溶解，鋁模覆蓋，上機檢測。檢測結果運用軟件Chemo View 1.2計算出所測樣品中代謝產物濃度值。

1.6 數據采集與分析

通過電化學原理將被檢測物質分子電離成不同質荷比（m/z）的帶電粒子，并根據m/z大小生成分離排列的圖譜對離子峰的強度進行測定，采用定量分析軟件自動計算出所測樣本氨基酸代謝產物濃度值，利用SIMCA-P 13.0數據處理軟件，采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 對患兒血代謝物質進行分析，尋找差異代謝物。評價OPLS-DA模型匹配度的3個關鍵指標：R2X表示X矩陣解釋率；R2Y表示Y矩陣解釋率；R2X與R2Y反映了模型穩定性；Q2表示模型預測性；R2X、R2Y、Q2三者均大于0.5表示模型匹配良好。根據OPLS-DA模型輸出聚類圖和變量得分圖（Score Plot，S-Plot），聚類圖中2組物質分布在左右2個區域提示2組代謝物存在顯著差異；S-Plot圖中越偏向兩極的物質具有越大的協方差和相關性，以此篩選差異代謝物，隨后進行權重分析：根據變量差異貢獻（variable importance in projection，VIP）比較，篩選出VIP>1的血差異代謝物。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料采用中位數（四分位數間距）M（P25，P75）描述，組間比較采用秩和檢驗。計數資料采以例數和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。使用Medcalc軟件進行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，計算ROC曲線下方部分的面積（area under the curve， AUC）、 靈 敏 度 （sensitivity）、 特 異 度（specificity），評價差異代謝物對ROP的診斷預測效果，并尋找最佳的指標診斷的截斷值。

2 結果

2.1 兩組患兒基本情況

ROP組和非ROP組各21例，臨床資料見表1。兩組出生胎齡、體重、出生身長、吸氧時長、NRDS比例的比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

表1 ROP組與非ROP組臨床資料比較

2.2 血代謝譜模式識別分析

利用OPLS-DA模型對ROP組和非ROP組患兒血代謝譜進行分析。ROP組和非ROP組患兒的OPLSDA模型聚類圖見圖1。該模型參數：R2Xcum=0.686，R2Ycum=0.907，Q2=0.522，均>0.5，表明該模型解釋能力較好，穩定性和預測性較高。ROP組和非ROP組的血代謝物質分布在左右兩個區域，提示兩組之間血代謝產物存在顯著差異。

圖1 ROP患兒和非ROP患兒血代謝物的OPLS-DA聚類圖 橫坐標t［1］表示預測組分，呈現組間差異；縱坐標to［1］表示正交組分，呈現組內離散程度；圓點旁邊數字表示樣本編號，綠色圓點1~21為ROP組，藍色圓點22~42為非ROP組。

2.3 血代謝物差異物質篩選

根據血代謝物數據輸出S-Plot圖，圖中偏向兩極的為兩組差異較大的物質，即最有可能為生物標志物。位于S-Plot圖兩極的共有8個物質（圖2紅色標記），初步篩選差異較大的代謝物有：谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸及精氨酸（圖2）。

2.4 血代謝物權重分析

使用OPLS-DA模型分析變量重要性得分評價變量貢獻，VIP值越大，代表該物質對于區分兩組所具有的貢獻越大。因此篩選出VIP>1的血代謝產物，選擇排名前10的物質：谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸（表2）。

表2 ROP組和非ROP組患兒血代謝物中VIP>1的代謝物

2.5 重要血代謝物統計學分析

針對血代謝物權重分析VIP值排名前10的代謝物進行t檢驗或者秩和檢驗分析：符合正態分布的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸及精氨酸采用t檢驗進行分析；不符合正態分布的鳥氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸，采用秩和檢驗進行分析。統計分析顯示，ROP組谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、甘氨酸水平均高于非ROP組，差異具有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 ROP組和非ROP組患兒血代謝物水平比較 （μmol/L）

2.6 ROC曲線分析預測ROP中潛在的生物標志物

針對t檢驗及秩和檢驗統計分析有差異的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、甘氨酸5個氨基酸進行ROC曲線分析，尋找潛在的代謝生物標志物。通過比較AUC值、靈敏度、特異度，選出診斷價值較高的生物標志物，并計算出診斷的截斷值。AUC值越高，曲線越接近左上角（靈敏度及特異度越大），預測準確率越高。分析結果如表4、圖3所示，可見5種氨基酸都有較高的預測診斷價值，其中谷氨酸和鳥氨酸AUC值、靈敏度和特異度均較高，可見它們在識別ROP方面是所有代謝物中最好的，其參考截斷值分別為223.92 μmol/L、53.07 μmol/L。

圖3 ROP潛在代謝標志物的ROC曲線 谷氨酸與鳥氨酸對ROP的診斷價值最高。

表4 ROP潛在代謝標志物的ROC曲線分析

3 討論

ROP是各種因素導致的微血管變性后新生血管增生性疾病，早產、低出生體重、過度用氧是公認的危險因素［6］。胎兒視網膜血管在16周左右開始發育，直至足月才成熟。為了避免早產兒出生后未及時診斷及治療而導致視力受損甚至致盲的風險，在視網膜發育的過程中，需要定期檢查眼底了解血管生長情況。由于技術和條件限制，部分地區甚至無法開展ROP篩查。近年來隨著代謝組學和串聯質譜技術發展迅速，并逐漸應用于各種疾病，如小兒哮喘、苯丙酮尿癥、先天性腎上腺皮質增生癥、新生兒支氣管肺發育不良等的早期識別、精準診斷及個體化治療［7-10］。本研究對ROP患兒的血代謝產物進行分析，以尋找可預測診斷ROP的生物標志物。

Fu等［11］總結了ROP與代謝相關的研究，發現圍生期早期的代謝失調是ROP和其他早產兒遠期并發癥的一個強有力但未被充分研究的危險因素，說明視網膜血管的生長發育與機體代謝密切相關。Zhou等［12］對需要治療的ROP患兒與無需治療的ROP患兒的代謝物進行分析，發現多個物質的變化主要富集于蛋白質消化吸收和氨基酰基-tRNA生物合成途徑。Nilsson等［13］對早產兒多個時間點的代謝物進行研究，發現早產兒低水平的1-磷酸鞘氨醇與嚴重ROP的發生發展有關。另外，在新生小鼠的實驗中發現，饑餓、高血糖狀態增加了視網膜細胞凋亡、減慢神經元的生長和促進了視網膜新生血管的生長［14-15］。本研究對早產兒ROP組及非ROP組的代謝情況進行比較，結果顯示有5種差異代謝物即谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸及甘氨酸，其中谷氨酸及鳥氨酸對ROP預測診斷價值最高，可以作為早期識別診斷ROP的生物標志物，另外其可能在ROP疾病發展的過程中起到調節作用，需要更多動態的代謝數據進行研究及驗證，有望通過營養調節、改變機體代謝情況來調節視網膜血管的生長發育過程。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，儲存于視網膜神經節細胞、雙極細胞及光感受細胞神經末梢的突觸囊泡內，在視覺系統中有重要生理作用［16］。視網膜中多數興奮性信號由谷氨酸介導，但神經突觸間隙中過量的谷氨酸可引起視網膜神經元損傷甚至死亡［17］。已有多個研究發現ROP患兒體內谷氨酸水平升高且與ROP發生呈正相關，對ROP有良好的診斷價值［18-21］。本研究中ROP組患兒谷氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，與既往研究［18-21］一致，提示高濃度的谷氨酸可能與ROP的發生發展有關。ROC曲線分析提示谷氨酸對預測ROP的靈敏度及特異度高，可作為ROP早期預測標志物或輔助診斷依據。

亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一。研究發現，富亮氨酸α-2糖蛋白1（leucinerich α-2-glycoprotein 1，LRG1），是一種富含亮氨酸的α-2-糖蛋白，它可以通過轉化生長因子-β信號通路，促進內皮細胞遷移，參與異常血管生成的病理過程［22］。Mundo等［23］研究發現 LRG1 在視網膜黃斑變性患者的血管內皮細胞及脈絡膜新生血管膜周圍組織中的水平較高，結果支持了抗LRG1單克隆抗體成為治療新生血管相關視網膜病的候選治療靶點。另外，視網膜中富含亮氨酸的小蛋白多糖，在許多與纖維和血管生成有關的上游信號中發揮著重要作用，可調節細胞分化、黏附、生長和修復機制［24］。本研究發現ROP組患兒的亮氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示ROP患兒視網膜的異常血管增殖可能與亮氨酸有關。

鳥氨酸是尿素循環的中心部分，可以促進氨的排泄，天冬氨酸參與鳥氨酸循環。鳥氨酸-天冬氨酸被推薦為減少運動疲勞的營養補充劑之一［25］。但有研究發現高濃度的鳥氨酸對視網膜色素上皮細胞具有特異性毒性，長期攝入過多鳥氨酸有視網膜病變風險［26］。本研究發現ROP組患兒鳥氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示高濃度鳥氨酸可能增加了患兒視網膜病變風險。有一項多中心前瞻性隊列研究分析發現天冬氨酸的攝入量與增生性糖尿病視網膜病變的發生率有關［27］，但具體機制尚不清楚。本研究ROC曲線分析提示鳥氨酸對ROP的鑒別價值高，鳥氨酸可作為ROP早期預測診斷的代謝標志物。

甘氨酸是一種非必需氨基酸，參與蛋白質的合成和許多重要的生理功能。有研究發現甘氨酸可以模擬血管內皮生長因子對視網膜微血管內皮細胞的作用，促進體外和體內血管生成，還能有效地保護血管內皮細胞的線粒體功能［28］。此外，甘氨酸可促進血紅素的生物合成，血紅素在控制活性氧水平和維持氧化磷酸化中起關鍵作用，從而為血管增殖提供良好的環境［29-30］。最近有研究發現ROP患兒體內甘氨酸水平升高［31］，本研究與之一致，提示甘氨酸可能與ROP患兒視網膜血管過度增殖有關。

綜上所述，本研究通過液相色譜-質譜技術和代謝組學方法比較了ROP患兒與非ROP患兒的血代謝產物，結果提示5種氨基酸存在明顯差異，是ROP的潛在標志物，其中谷氨酸與鳥氨酸對ROP診斷價值最高，可以作為ROP早期診斷的生物標志物，有助于ROP的早期識別與診斷。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。