N-myc下游調節基因2對巨噬細胞極化及乳腺癌增殖、侵襲和遷移的影響

皮美辰 陳文馨 柳周 汪長華 孫圣榮

乳腺癌是世界范圍內最常見的女性原發惡性腫瘤之一[1]，在20～59歲女性中的發病率居于首位，并且呈現出年輕化的趨勢[2]。尋找乳腺癌發生和進展的新機制，為乳腺癌治療探索方向顯得尤為重要。N-myc下游調節基因2(NDRG2)蛋白是N-myc下游調節基因家族的成員，在惡性腫瘤的增殖、分化和轉移中發揮重要作用[3]。巨噬細胞由于其巨大的可塑性，在腫瘤發生和進展中發揮重要作用[4]。乳腺微環境中，巨噬細胞可在不同刺激下極化為抑瘤型M1或促瘤型M2。M2型巨噬細胞被認為與乳腺癌進展相關[5]。探究巨噬細胞極化導致乳腺癌進展的機制或許能為乳腺癌治療帶來新的方向。

材料與方法

一、材料與方法

1.病人樣本：本研究獲得了武漢大學人民醫院倫理委員會批準(批件號2018K-C09)。實驗使用的所有乳腺癌及癌旁組織標本均來自武漢大學人民醫院。

2.細胞共培養：在孔徑為0.4 μm的Transwell培養板(Millipore)中進行小鼠RAW264.7巨噬細胞和小鼠乳腺癌細胞4T-1共培養，上室為RAW264.7細胞，下室為4T-1細胞。共培養48小時后，對乳腺癌細胞4T-1進行細胞遷移和侵襲實驗。

3.生物信息學分析：乳腺癌病人的mRNA數據譜和臨床病理特征來自癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。

4.細胞轉染：含有小鼠NDRG2野生型(WT)或NDRG2突變型(MUT)的質粒購自GeneChem Biotechnology公司。靶向小鼠NDRG2的小干擾RNA(siRNA)由QIAGEN公司合成。根據生產商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑對巨噬細胞進行轉染。實驗中使用的siRNA及其配對對照最有效的序列如下：5′-CCGUGGUGGAAUGUAACUCAATT-3′， 5′-CAGGAAGAGCUUUCUGGAAAUTT-3′。

5.細胞增殖：經過前期處理后，按每孔2 000個將4T-1細胞鋪于96孔板中，培養3天。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育細胞2小時，然后在450 nm處測定樣品的吸光度。

6.劃痕實驗檢測細胞遷移：將共培養完成的乳腺癌細胞接種到6孔板中，待細胞生長至100%匯合度時，用200 μl移液器吸頭劃破細胞層，細胞表面可見一直線劃痕，在0小時、24小時和48小時分別用顯微鏡觀察劃痕并拍照，使用Image J軟件測量劃痕面積，計算劃痕愈合率。

7.Transwell檢測細胞侵襲：方法如前所示[6]。Western blot方法如前所示[6]。

二、統計學分析

結果

1.NDRG2在乳腺癌組織中的表達及其與不良預后的關系：從TCGA數據庫挖掘NDRG2 mRNA表達數據發現，NDRG2在乳腺癌組織中的表達遠低于正常乳腺組織(圖1A)。用Western blot法檢測乳腺癌病人癌組織和癌旁組織樣本發現，與生物分析結果一致，NDRG2在乳腺癌組織中的表達顯著低于癌旁組織。(圖1B～C)。生存分析顯示，無論是總生存期(overall survival，OS)，還是無復發生存期(relapse-free survival，RFS)，NDRG2低水平組都比NDRG2高水平組的預后差(圖1D)。

2.NDRG2與乳腺癌病人臨床病理特征的關系：依據TCGA數據庫數據分析顯示，NDRG2的表達與乳腺癌病人的性別、轉移、分期和分子分型有關。男性乳腺癌病人和出現遠處轉移的乳腺癌病人表現出更低的NDRG2水平(圖2A～B)。與其他分型比較，HER2陽性型的乳腺癌病人表現出最低的NDRG2水平(圖2C)，并且隨著腫瘤進展，NDRG2的水平持續下降(圖2D)。

3.NDRG2敲低促進巨噬細胞向M2型極化：為了探究NDRG2對巨噬細胞極化的影響，用NDRG2 siRNA和其配對對照(scramble siRNA)轉染了Raw264.7巨噬細胞。結果顯示，與scramble siRNA組相比，NDRG2 siRNA組M2型巨噬細胞分子標志物CD206的表達顯著增加，M1型巨噬細胞分子標志物CD80的表達顯著降低(圖3A～B),這表明巨噬細胞內NDRG2敲低會促進巨噬細胞向M2型分化。

4.NDRG2G過表達抑制巨噬細胞向M2型極化：為了加強結論，我們還利用含有NDRG2 cDNA的質粒過表達這個基因觀察巨噬細胞極化狀態的改變。見圖4A～B。結果表明，與對照組比較，NDRG2過表達組CD206的表達被顯著抑制，CD80的表達卻增加。表明NDRG2過表達會抑制巨噬細胞向M2型極化。

5.巨噬細胞內NDRG2缺失促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移：為了探究NDRG2是否能通過影響微環境免疫狀態的改變而影響乳腺癌進展，我們模擬乳腺微環境將巨噬細胞與乳腺癌細胞4T-1共培養以觀察巨噬細胞內NDRG2的缺失對4T-1細胞增殖、侵襲及遷移的影響，結果顯示，巨噬細胞內NDRG2的缺失顯著增加了乳腺癌細胞4T-1的增殖、遷移和侵襲(圖5A～C)。

6.巨噬細胞內NDRG2過表達抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移：為了加強結論，用含有NDRG2 cDNA的質粒轉染RAW264.7巨噬細胞以過表達NDRG2，隨后再與4T-1細胞共培養。結果顯示，與對照組比較，NDRG2過表達組乳腺癌細胞4T-1的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制(圖6A～C)。總之，這些結果表明乳腺腫瘤微環境中巨噬細胞NDRG2的減少促進了乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

A.TCGA數據庫中乳腺癌病人與正常人中NDRG2 mRNA的表達。B、C.Western blotting檢測乳腺癌組織及配對癌旁組織中NDRG2蛋白表達。D.NDRG2表達對乳腺癌OS及RFS的影響。aP<0.01，bP<0.0001

圖2 NDRG2表達水平與轉移、性別、腫瘤分期和分子亞型的關系。aP<0.05，bP<0.001，cP<0.000 1

A、B.Raw264.7細胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低對巨噬細胞生物標志物CD80和CD206蛋白水平的影響。aP<0.01，bP<0.001

A、B.Raw264.7細胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低對巨噬細胞生物標志物CD80和CD206蛋白水平的影響。aP<0.05，bP<0.01圖4 過表達NDRG2抑制巨噬細胞向M2型極化

A.通過CCK-8實驗測定細胞增殖。B.通過劃痕實驗測定遷移(×40)。C.通過Transwell實驗測定侵襲(×200)。aP<0.05，bP<0.001

A.通過CCK-8實驗測定細胞增殖。B.通過劃痕實驗測定遷移(×40)。C.通過Transwell實驗測定侵襲(×200)。aP<0.01，bP<0.000 1。圖6 過表達巨噬細胞內NDRG2抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

討論

目前，乳腺癌已經成為全球女性中最常見的癌癥[7-8]。 巨噬細胞是腫瘤微環境中最豐富的免疫細胞類型之一。因為極好的清除和修復作用，巨噬細胞對于先天性免疫應答至關重要。然而，當巨噬細胞轉化為腫瘤相關巨噬細胞時，這些作用反而會促進腫瘤進展[9-10]。巨噬細胞能在不同的刺激條件下極化為經典的M1抗腫瘤表型或替代激活的M2促腫瘤表型，M2巨噬細胞的聚集往往代表著不良臨床預后[11]。因此，闡明巨噬細胞極化的機制及對乳腺癌的影響對乳腺癌預后改善具有積極意義。

生信分析的結果表明，NDRG2可能在乳腺癌中發揮抑癌作用。乳腺癌組織中存在大量的巨噬細胞，組織中NDRG2 mRNA的變化可能也包括巨噬細胞中NDRG2 mRNA的變化，由于NDRG2水平改變會影響巨噬細胞極化狀態的改變，而巨噬細胞的極化狀態又會直接影響乳腺微環境的免疫狀態。所以本研究進行體外實驗以探究巨噬細胞內NDRG2下調對乳腺癌進展的影響。結果表明，NDRG2缺失不僅促進巨噬細胞向M2型極化還促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

乳腺癌中NDRG2表達下調，NDRG2缺失促進微環境中巨噬細胞向M2型極化隨后促進乳腺癌的增殖、遷移和侵襲。