CKLF1-C19多肽影響口腔黏膜下纖維性變中MFB活化及對SFRP表達的影響*

李艷莉 徐仰龍 鄧金勇 何升騰 董方

(1.三亞中心醫院口腔科，海南 三亞 572000;2.遵義醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科，貴州 遵義 563003;3.三亞市人民醫院口腔科，海南 三亞 572000)

口腔黏膜下纖維性變(Oral submucous fibrosis，OSF)是亞洲國家常見的口腔癌前病變，由口腔黏膜結締組織中異常的膠原蛋白沉積所引起，往往伴隨組織纖維化，患者會出現口干、潰瘍、燒灼刺痛感、口腔活動受損以及進行性張口受限等癥狀[1-3]。研究表明，7%～30%的OSF患者可能會轉化為口腔癌，且隨著OSF患者數量的增多，惡變風險也在逐漸升高[4]。OSF的病變組織內存在纖維化頰粘膜肌成纖維細胞(Myofibroblast，MFB)，能夠表達平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，具有較好的收縮性及膠原分泌能力，活化的MFB是導致纖維化過程中細胞外基質積累的關鍵致病細胞[5]。因此在OSF中以MFB為作用靶點抑制增殖、遷移及侵襲等生物學行為，逆轉成纖維細胞向其分化，是OSF潛在的治療策略。

人趨化素樣因子(Chemokine-like factor 1，CKLF1)是趨化因子樣因子蛋白家族的一員，作為CCR4 的功能配體，其在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣譜的生物學功能。CKLF1 包含至少兩個位于其C末端的分泌亞型，其中一種為CKLF1-C19多肽，簡稱C19，從果蠅S2細胞中穩定表達時所分泌，可作為CKLF1的拮抗劑在多種疾病中發揮抑制作用[6-7]。目前已有研究表明，C19對TGF-β誘導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化具有抑制作用，并能夠抑制氣道重塑和纖維化的發生[8]。本研究通過使用C19處理OSF患者MFB觀察細胞活化的變化，并探討C19影響OSF的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月～2021年1月在三亞中心醫院口腔科門診就診并確診為OSF的患者8例，其中男6例，女2例，年齡38～51歲，平均(40.95±3.98)歲，均有咀嚼檳榔習慣。選擇同期體檢的健康志愿者8例，其中男5例，女3例，年齡37～48歲，平均(39.75±3.66)歲，均無咀嚼檳榔、飲酒及吸煙等行為，且無口腔黏膜病變和其他急性或慢性炎癥性疾病。本研究獲得患者知情同意以及三亞中心醫院倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑 CKLF1-C19多肽(中國疾病基因研究中心)；胎牛血清(浙江天杭生物科技公司)；DMEM培養基和胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；免疫熒光染色試劑盒和CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技公司)；羥脯氨酸檢測試劑盒(英國Abcam公司)；Trizol(日本Takara公司)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物公司)；DAPI染液、Phallacidin染液和I型鼠尾膠原(北京索萊寶生物公司)；Transwell小室、BCA蛋白測定試劑盒和結晶紫染液(上海碧云天生物研究所)；Pierce ECL化學發光試劑液(上海索寶生物科技公司)；鼠抗人α-SMA、sFRP1、sFRP2、sFRP5單克隆抗體以及兔抗人GAPDH單克隆抗體(英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1 FB和MFB分離、培養與鑒定 取兩組頰部對應位置黏膜組織，采用組織塊法分離培養原代細胞。用含抗菌素的PBS清洗黏膜組織3次，每次3 min，分離上皮下組織并剪成約1 mm3的小塊，將小塊放入培養瓶內，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中貼壁培養，當組織塊周圍有細胞生長，且融合達到80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態，選擇第三代至第六代細胞用于實驗。

1.3.2 免疫熒光染色 原代培養的細胞傳至第5代時，進行細胞爬片，進行α-SMA和F-actin的免疫細胞熒光染色。細胞爬片后，4℃下以4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗干凈，pH7.4的PBS處理5 min，0.1% Triton X-100繼續作用5 min，再以5%BSA封閉20 min，PBS清洗干凈后，在玻片上滴加鼠抗人α-SMA單克隆抗體和Phallacidin試劑液，室溫避光染色20 min，PBS清洗干凈，采用DAPI復染10 min，清洗后封片，通過掃描共焦顯微鏡觀察染色情況。

1.3.3 細胞分組與處理 選擇生長狀態良好的第5代MFB，以1×104個細胞接種入96孔板，置于37℃、5%CO2的恒溫箱過夜培養。實驗分組設置為對照組、0.001 mg/L C19組、0.01mg/L C19組、0.1 mg/L C19組，對照組細胞正常培養，各濃度C19處理組分別加濃度為0.001、0.01、0.1 mg/L的CKLF1-C19多肽培養，48 h后收集細胞進行后續研究。

1.3.4 CCK-8法 將MFB按照1.3.3處理，結束后置于37℃、5%CO2的恒溫箱內孵育，分別于24、48、72 h 時，加入10 μL CCK-8試劑液至待測細胞孔中，輕輕混勻，繼續孵育4 h，通過全自動酶標儀測定450 nm 處各孔細胞的光密度(OD)值。

1.3.5 羥脯氨酸含量 測定收集處理后的各組MFB，4℃下以4000 rpm/min離心10 min，獲取各組樣本的上清，測定羥脯氨酸的含量，具體步驟嚴格根據試劑盒說明書進行。

1.3.6 膠原凝膠收縮實驗 將Ⅰ型鼠尾膠原溶液配制成2 mg/mL的新鮮膠原混合液，收集處理后的各組MFB，胰蛋白酶消化后，使用無血清DMEM培養液重懸，并以2×105個/mL接種于膠原液中，混合后，取500 μL接種于24孔板中，置于37℃下孵育2 h，使細胞貼附于凝膠表面，進一步置于恒溫箱內孵育48 h，觀察膠原凝膠收縮情況，數碼相機攝像，使用ImageJ軟件分析膠原凝膠面積，測定培養后凝膠面積與凝膠初始面積的百分比。

1.3.7 細胞遷移與侵襲檢測 使用帶8 μm孔徑的聚碳酸酯濾膜的24孔Transwell小室測定各組MFB的遷移和侵襲能力。在細胞侵襲測定中，濾膜涂基質膠以覆蓋膜孔。在上室中加入100 μL含1×103個細胞的懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的新鮮培養液。置于37℃、5%CO2恒溫箱中孵育24 h，將其下表面在4%多聚甲醛中固定后，結晶紫染色，PBS清洗后封片，光學顯微鏡觀察膜下細胞數目，計數5個不同視野取平均值。

1.3.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應 各組MFB中加入適量Trizol，提取總RNA，分光光度計檢測純度與濃度。根據第一鏈cDNA合成試劑盒，將總RNA逆轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR系統進行擴增，檢測各基因mRNA的表達水平，按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行。擴增條件如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 10 s，40個循環；溶解曲線：95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s。以GAPDH作為內參基因，使用2-ΔΔCt法來計算目的基因表達量，引物序列，見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.3.9 Western blot檢測 在各組MFB中加入RIPA溶液，置于冰上裂解30 min，4℃下以12000 r/min離心30 min，收集上清，BCA法測定蛋白質量。取等量蛋白樣品，在制備的10%SDS-PAGE凝膠孔內上樣，電泳分離，將分離的蛋白電轉至PVDF膜，將膜放在5%脫脂奶粉中，室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗工作液(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日，棄去原液，TBST充分洗膜后，加入對應二抗工作液(1∶5000)，室溫孵育1 h，利用Pierce ECL化學發光底物顯影，凝膠系統成像，ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內參蛋白。

2 結果

2.1 FB與MFB的鑒定結果 在倒置顯微鏡下可見培養的FB與MFB大多呈長梭形，胞體較大，胞核為卵圓形，MFB較FB更加飽滿，體積增大，且形態較不規則，細胞增殖加快(見圖1)。α-SMA和F-actin免疫熒光染色結果顯示，從健康志愿者的頰黏膜組織中分離的FB，α-SMA染色為陰性，F-actin染色呈紅色熒光，主要分布在細胞膜；從OSF患者的頰黏膜組織中分離的MFB，α-SMA染色呈綠色熒光，F-actin染色呈紅色熒光，兩者均在形成束狀纖維結構分布于細胞質內。見圖2。

圖1 FB與MFB的形態觀察(比例尺=20 μm)Figure 1 Observation of the morphology of FB and MFB

圖2 FB與MFB內α-SMA和F-actin表達檢測(免疫熒光染色，比例尺=20 μm)Figure 2 Detection of α-SMA and F-actin expression in FB and MFB

2.2 CKLF1-C19多肽對MFB增殖活性的影響 CCK-8檢測結果顯示，與對照組比較，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB，在培養48 h和72 h后，細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)，各劑量對細胞增殖活性的抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組MFB增殖活性比較Figure 3 Comparison of MFB proliferation activity in each group

2.3 CKLF1-C19多肽對MFB上清中羥脯氨酸含量的影響 各組MFB培養液上清中羥脯氨酸含量測定結果顯示，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB上清中羥脯氨酸的含量均顯著低于對照組MFB上清中羥脯氨酸的含量(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組細胞上清中羥脯氨酸的含量顯著降低(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組細胞上清中羥脯氨酸的含量也顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組MFB上清中羥脯氨酸含量比較Figure 4 Comparison of hydroxyproline content in MFB supernatant of each group注：與對照組比較，①P<0.05；與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.4 CKLF1-C19多肽對MFB收縮活性的影響 膠原凝膠收縮實驗結果顯示，與對照組比較，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB與膠原混合培養后，膠原凝膠收縮面積比率均顯著增加(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組膠原凝膠收縮面積比率顯著增加(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組膠原凝膠收縮面積比率也顯著增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組MFB收縮活性比較 Figure 5 Comparison of MFB contractile activity in each group注：A.膠原凝膠收縮實驗檢測各組MFB膠原情況；B.各組MFB膠原凝膠收縮面積比率。與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.5 CKLF1-C19多肽對MFB內分泌型卷曲相關蛋白表達的影響 qRT-PCR實驗測定結果顯示，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB內sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平均較對照組顯著上調(P<0.05)；0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組中sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平較0.001 mg/L C19組顯著上調(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平進一步顯著上調(P<0.05)。而不同濃度C19多肽處理下的sFRP5 mRNA表達水平與對照組sFRP5 mRNA表達水平之間差異均無統計學意義(P>0.05)(見圖6)。Western blot檢測結果也顯示，與對照組比較，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB內sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平均顯著上調(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組中sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平進一步顯著上調(P<0.05)，而各組之間的sFRP5 蛋白表達水平的變化差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖6 各組MFB內sFRP1、sFRP2及sFRP5的mRNA表達水平比較Figure 6 Comparison of mRNA expression levels of sFRP1,sFRP2 and sFRP5 in each group of MFB注：與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

圖7 各組MFB內sFRP1、sFRP2及sFRP5的蛋白表達水平比較Figure 7 Comparison of the protein expression levels of sFRP1,sFRP2 and sFRP5 in the MFB of each group注：A.Western blot檢測各組MFB內sFRP1、sFRP1、sFRP5蛋白條帶；B.各組MFB內sFRP1、sFRP2、sFRP5蛋白的表達水平。與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.6 CKLF1-C19多肽對MFB遷移與侵襲的影響 Transwell實驗測定結果顯示，與對照組比較，經過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB，遷移細胞數目與侵襲細胞數目均顯著減少(P<0.05);相較于0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組遷移細胞數目與侵襲細胞數目均顯著減少(P<0.05)；0.1 mg/L C19組遷移細胞數目與侵襲細胞數目均顯著少于0.01 mg/L C19組(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組MFB遷移與侵襲的數目比較 Figure 8 Comparison of the number of MFB migration and invasion in each group注：與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

3 討論

OSF是一種慢性口腔疾病，會導致疤痕產生以及組織纖維化，并具有惡性轉化潛力，最終可能引發口腔癌。由于其惡性轉化率逐漸增高，該疾病對死亡率也有顯著影響，據統計，OSF的發生因種族和地區而異，并與飲食、習慣和文化密切相關，南亞和東南亞的OSF患病率最高[9-10]。根據流行病學與相關研究表明，咀嚼檳榔是OSF重要的危險因素之一。為了減少OSF的發生，早期發現癌前病變、了解病理機制和探究治療方案均意義重大。本研究通過從OSF患者頰部病變黏膜組織分離MFB，觀察到在不同濃度CKLF1-C19多肽作用下對細胞增殖活性、收縮、遷移以及侵襲等能力活化相關指標產生了積極影響。

根據口腔黏膜的功能和組織學特征，可分為咀嚼型黏膜、特殊型黏膜和襯里型黏膜。OSF在這三種類型的黏膜上均發生，并最常發生在頰黏膜、磨牙后區域和軟腭部位。在OSF 病例中，最初口腔粘膜從柔軟的粉紅色逐漸變為沒有彈性并略微發白，隨后黏膜明顯無彈性、不透明，觸診時呈紙質白色且堅韌，在后期階段唇部和上顎也會發生一個甚至多個部位病變[11]。OSF患者在攝入辛辣食物后，口腔會出現嚴重燒灼感，此外，患者還會出現張口能力受限和口腔傷口愈合不佳等現象。MFB廣泛存在于瘢痕和纖維化的組織中，除了具備成纖維細胞的分泌功能外，還能夠發揮部分肌細胞的收縮功能，然而，在組織修復過程中持續激活MFB可導致修復機制異常，分泌富含膠原的纖維性基質，從而促使瘢痕攣縮及纖維化發生。MFB產生的α-SMA能夠結合到細胞內應力纖維中，在收縮時產生強大的力，MFB通過這些纖維控制細胞的形狀和運動、ECM重塑以及組織收縮[12-14]。本研究通過免疫熒光染色也發現了從OSF患者中分離培養的MFB中α-SMA高表達。此外，還有研究表明MFB表現出高水平的細胞因子、趨化因子、生長因子和細胞表面受體的誘導性，這使得細胞具有炎癥細胞的某些特性，能夠對各種炎癥、免疫和機械信號做出反應，并且纖維化組織中的MFB還顯示出對凋亡的高度抵抗性。結合以上觀點，MFB在OSF進展中可能發揮著重要作用。

以往研究[15]結果顯示C19在多項疾病中發揮積極作用，例如，C19通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-8等介質的產生來減少中性粒細胞對缺血區域的浸潤，防止大鼠局灶性腦缺血；C19在體內和體外抑制血管平滑肌細胞遷移和內膜增生，表明其在動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄中的保護作用[16]；C19通過抑制炎癥細胞的浸潤和微血管細胞的增殖來預防銀屑病[17]。本研究結果顯示，經過C19處理后MFB的增殖活性下降，細胞遷移與侵襲數目均減少，膠原凝膠收縮面積比率增加，同時，上清中羥脯氨酸的含量減少，由此說明C19能夠有效抑制MFB的活化。此外，羥脯氨酸是膠原組織代謝的指標，其含量變化反映了細胞上清中可溶性膠原含量的變化，間接說明纖維化的程度。

Wnt分泌蛋白是糖基化脂質修飾蛋白家族成員，在組織發育、組織穩態、細胞分化和細胞增殖中發揮重要作用，Wnt信號通路的異常激活與多種疾病的發病機制有關，而sFRP家族是Wnt信號通路的細胞外調節因子，具有與卷曲受體同源的富含半胱氨酸結構域，可以通過該結構域隔離Wnt或與卷曲受體形成無活性的復合物來抑制Wnt信號傳導[18-20]。sFRP含有sFRP 1～5五個成員，且均已在哺乳動物中得到鑒定。目前，已證實sFRP1、sFRP2與sFRP5能夠影響肌成纖維細胞的增殖、膠原合成以及成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化過程，與不同組織的纖維化發生相關[21-23]。鑒于此，本研究在C19處理后的MFB中檢測了這三種sFRP的表達變化，結果顯示出C19能夠下調sFRP1和sFRP2的表達，對sFRP5的表達未產生顯著影響。由此推測，C19調控sFRP1和sFRP2表達可能是影響OSF發生發展的一個分子機制。

4 結論

肌成纖維細胞在口腔黏膜下纖維性變的發病機制中發揮作用，CKLF1-C19多肽能夠抑制口腔黏膜下纖維性變頰粘膜組織中肌成纖維細胞的增殖活性、遷移及侵襲，降低膠原分泌能力，阻止了肌成纖維細胞的活化，這一作用可能與調控sFRP1和sFRP2的表達相關，可能為CKLF1-C19多肽治療OSF提供了實驗依據。