高齡卵巢低儲備人群不同促排卵方案的臨床評價*

簡生燕 熊正方 馬榮花 曾湘暉 王睿 李斌業

(青海省人民醫院生殖醫學中心，青海 西寧 810001)

自2015年10月全面實施二胎政策以來，高齡夫婦的生育需求也隨之增加，但年齡的增加導致卵巢功能及卵母細胞質量的下降和各種盆腔疾病的增加致使35歲以上的高齡女性妊娠率顯著下降，流產率增加[1-3]。體外受精-胚胎移植(Vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)或單精子卵泡漿內注射-胚胎移植(Intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI)的治療方法為她們的生育需求提供了技術支持，良好的妊娠結局取決于高質量卵子及優質胚胎。目前高齡卵巢低反應患者在IVF-ET促排卵過程中以促性腺激素釋放激素拮抗劑(Gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRH-ant)方案(簡稱為拮抗劑方案)、高孕激素狀態下促排卵 (Progestin primed ovarian stimulation,PPOS)方案(簡稱為PPOS方案)和微刺激方案為主。而促性腺激素釋放激素激動劑(Gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)降調節長方案(簡稱為長方案)較少應用于該類人群，本文探討高齡卵巢低儲備患者應用長方案、拮抗劑方案和PPOS方案的實驗室指標及臨床結局，旨在尋找適宜于高齡女性最優的促排卵方案，助力該類人群的輔助生育獲得最佳結局。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入2016年3月～2019年3月在青海省人民醫院生殖中心接受IVF助孕治療的高齡卵巢低儲備者377個周期的臨床資料。PPOS方案(PPOS組)198個周期、長方案(長方案組)103個周期和拮抗劑方案(拮抗劑組)76個周期。患者平均年齡(39.43±3.53)歲，平均BMI(22.37±3.08) kg/cm2，平均不孕年限(4.36±3.55)年。其中原發不孕123個周期(32.6%)，繼發不孕254個周期(67.4%)。參照其他研究[4-7]，制定納入標準：①年齡≥35歲。②陰道超聲提示早期雙側卵巢竇卵泡數(Antral follicle count，AFC)≤7個或基礎卵泡刺激素(Folliclestimulating，hormone，FSH)≥10 U/L。③符合IVF適應癥。排除標準：①有IVF禁忌癥的患者。②有卵巢手術史、子宮畸形、子宮肌瘤、子宮內膜病變、卵巢囊腫患者。③既往有子宮卵巢手術及放化療史患者。④夫妻雙方任何一方染色體異常。本研究患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 控制性促排卵方案(Controlled ovarian stimulation，COS)：①PPOS組于月經周期第2～3日起口服安宮黃體酮(醋酸甲羥孕酮，浙江仙琚制藥)10mg/d至取卵后10 d，同時口服來曲唑(芙瑞，浙江海正藥業股份有限公司)2.5 mg/d直到HCG注射日，根據患者卵巢儲備及卵泡生長情況皮下注射尿促卵泡素(麗申寶，廣州麗珠制藥)。②長方案組：在前一個月經周期的黃體中期(月經第21～22日)單次皮下注射GnRH-a激動劑醋酸曲普瑞林(3.75 mg/支)1.25 mg，注射后14 d經陰道超聲評價卵泡情況，當子宮內膜厚度小于5 mm，FSH<5IU/L,E2<50 pg/mL,LH<5IU /L時，給予尿促卵泡素(麗申寶，廣州麗珠制藥)至HCG注射日，促排卵期間根據卵泡大小和激素水平調整用藥劑量。③拮抗劑組：月經周期的第2天行性激素水平檢測及陰道超檢查，評估患者卵巢儲備功能，給予尿促卵泡素(麗申寶，廣州麗珠制藥)，監測卵泡發育情況并調整Gn用量，當主導卵泡直徑達到14 mm時，皮下注射0.25 mg/d的促性腺激素釋放激素拮抗劑(思則凱，默克雪蘭諾，瑞士)，直至HCG注射日。啟動劑量依據患者年齡、BMI、AMH及既往促排卵周期卵巢的反應性等因素綜合考慮決定。取卵、胚胎移植及鮮胚黃體支持：當雙側卵巢有2～3個卵泡直徑達到17～18 mm時，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG，珠海麗珠醫藥)6000～10000 U，誘導卵泡成熟。HCG注射后35～37 h經陰道超聲引導穿刺取卵抽吸14 mm以上卵泡，IVF進行受精(精液采用精子分離液密度梯度離心方法處理)，取卵后開始黃體支持，口服地屈孕酮(達芙通，10 mg)20 mg/日，同時黃體酮60 mg/d肌內注射，72 h后有可移植胚胎，排除宮腔、內膜及HCG日孕酮值升高等影響內膜容受性因素，給予移植2枚胚胎。PPOS組進行全胚冷凍。胚胎質量評判：卵裂期D3胚胎評分標準[8]：Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形狀規則，無明顯DNA碎片；Ⅱ級：卵裂球大小略不均，形態略不規則，DNA碎片<20%；Ⅲ級：卵裂球大小明顯不均，DNA碎片20%～50%；Ⅳ級：DNA碎片>50%。卵裂期優質胚胎定義為：D3胚胎評分為Ⅰ～Ⅱ級，卵裂球數為6～9枚。凍融胚胎移植(FET)及黃體支持：患者至少有2個D3可移植胚胎，根據患者不孕原因、月經情況等個體化選擇內膜準備方案。自然周期：有正常排卵患者于月經8～9 d起監測排卵，排卵后給予口服地屈孕酮40 mg/日，3 d后在彩超陰道下進行胚胎移植。人工周期：月經2～3 d開始口服17β-雌二醇，4～6/mg，連服7 d后開始陰道超聲監測子宮內膜厚度及形態，調整17β-雌二醇劑量，當內膜厚度達到8 cm以上，并口服藥物時間達11 d以上，給予口服地屈孕酮40 mg/日，同時黃體酮凝膠90 mg/d陰塞轉化內膜后在超聲引導下移植胚胎。妊娠結果判斷：胚胎移植后14 d采集患者空腹靜脈血β-hCG，陽性者并于2周后B超檢查見孕囊者確診為臨床妊娠，妊娠者監測至妊娠3個月，妊娠3個月內出現的流產為自然流產。觀察指標：Gn天數和總量、注射HCG日E2、LH、P、直徑≥1.4cm卵泡數，獲卵數、MⅡ卵數、2PN受精數、優質胚胎數、早發LH峰等臨床指標；計算獲卵率、正常受精率、優胚率、周期取消率、胚胎種植率、累積臨床妊娠率、流產率指標。

2 結果

2.1 3組患者一般情況比較 患者的年齡、BMI、不育年限、AFC、bE2、bFSH、bLH等觀察指標在各組間差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者一般情況比較Table 1 Comparison of the general information among the three groups

2.2 患者促排卵周期臨床及實驗室指標 3組中長方案組Gn的使用總量最高，且明顯高于PPOS組和拮抗劑組(P<0.001)，長方案組使用Gn的天數也顯著長于其他兩組(P<0.001)。拮抗劑組和PPOS組的HCG日LH平均水平均高于長方案組，拮抗劑組最高，為長方案組的3.3倍,PPOS組次之，是長方案組的2.8倍,差異均有統計學意義(P<0.001)。HCG日P值在拮抗劑組和長方案組差異有統計學意義(P<0.05)。HCG日E2最低為PPOS組，其次為長方案組，拮抗劑組最高，前者明顯低于后兩組(均P<0.001)。卵泡直徑≥1.4 cm最多的為拮抗劑組(M=5)，最少的為PPOS組(M=5)，拮抗劑組和長方案組均多于PPOS組，差異均有統計學意義(P<0.001)。PPOS方案組的MⅡ卵泡成熟度、2PN受精數及優胚數最低，長方案的MⅡ卵泡成熟度、2PN受精數和優胚數均高于其他兩組，差異有統計學意義(均P<0.001)(見表2)。拮抗劑組的早發LH峰明顯高于長方案組(P<0.05)。3組獲卵率最高者為PPOS組，其次為長方案組，最低者為拮抗劑組，PPOS組獲卵率顯著高于拮抗劑組(P<0.001)。正常受精率拮抗劑組最高，其次是長方案組，均高于PPOS組(P<0.001)。長方案組的優質胚胎率最高達76.8%，拮抗劑組僅為62.3%，兩組差異有統計學意義(P<0.001)。3組患者間周期取消率差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 3組患者促排卵周期臨床及實驗室指標比較[M(q25,q75)]Table 2 Comparison of clinical and laboratory indexes in ovulation stimulation cycle among the three groups

表3 3組患者促排卵周期臨床及實驗室指標比較Table 3 Comparison of clinical and laboratory indexes in ovulation stimulation cycle among the three groups

2.3 3組患者的妊娠結局 研究發現，在鮮胚移植中長方案組的妊娠率高于拮抗劑組，而拮抗劑組的鮮胚移植取消率高于長方案組，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。在累積妊娠結局的比較，中長方案組的累積胚胎種植率高于拮抗劑組和PPOS組，長方案組與PPOS組比較差異有統計學意義(P<0.05)；長方案組的累積臨床妊娠率和累積活產率均高于拮抗劑組和PPOS組，但3組間差異無統計學意義(P>0.05)。3組患者的流產率差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組患者妊娠結局比較Table 4 Comparison of pregnancy outcomes among the three groups

3 討論

年齡是影響女性IVF-ET臨床結局的主要因素之一[9]。隨著女性年齡的增長伴隨卵子數目的逐漸減少，同時卵母細胞胞漿內過氧化反應增強，氧自由基增加[10-11]，導致卵母細胞質量下降，在胚胎分裂過程中染色體非整倍體率增加[12-14]，妊娠率降低，流產率也增加。

本研究應用3種不同促排卵方案對高齡卵巢低儲備患者377個周期的臨床實驗室檢查指標及臨床妊娠相關結局進行評價，研究發現PPOS組的獲卵率最高，其次為長方案組。然而，研究結果發現長方案組的MⅡ卵數、2PN受精數和優胚數均高于其他兩組；PPOS方案組的MⅡ卵數、2PN受精數及優胚數最低。說明雖然PPOS組的獲卵率高，但該組的卵泡成熟度及正常受精數卻不高，導致優胚數下降。所以，在高齡卵巢低儲備人群中保障獲取足夠數量的成熟卵子將為成功妊娠奠定良好的先決條件。已有研究[15]發現，在輔助生殖促排卵過程中，當獲卵數<15枚時，活產率隨著獲卵數的增加而升高。長方案組的降調節作用可以很好的抑制促卵泡生成素(Follicle Stimulation Hormone，FSH)，促進卵泡的同步發育，同時降調節作用也可以有效的抑制內源性LH峰，防止卵泡過早黃素化及早排的發生，這是提高卵母細胞質量和胚胎質量的重要條件[16]。

本研究中HCG日LH水平在拮抗劑組中最高，其次為PPOS組，長方案組最低；相對應的呈現出了拮抗劑方案中的早發LH峰最多(5例)，其次為PPOS組(2例)，長方案組最低僅1例。研究再次提示長方案在抑制早發LH峰的作用中優于PPOS方案及拮抗劑方案。研究報道在正常卵巢儲備患者中有0.34%～8.0%的患者使用拮抗劑方案抑制早發LH峰失敗[17-18]。2015年Lefebvre等[19]研究表明，拮抗劑方案在卵巢低反應患者中不能改善獲卵率及妊娠結局，即使增加Gn使用劑量也不能增加獲卵數。拮抗劑方案的不足之處即為卵泡均一性較差，獲卵率較低，尤其表現在高齡患者，這是由于在高齡卵巢低儲備患者的前一周期的黃體后期即可有增高的FSH募集卵泡的生長，這使高齡卵巢低儲備的患者卵泡早期就有較大卵泡的生長。而且該類患者在促排卵過程中容易發生早發LH峰，導致卵泡早排[20]，周期取消率高。

妊娠結局的比較中，長方案的鮮胚妊娠率和累積臨床妊娠率均高于拮抗劑方案，長方案組的累積胚胎種植率高于拮抗劑方案組和PPOS方案組。但只有長方案和PPOS方案組胚胎種植率比較差異有統計學意義，其余組別比較無統計學意義，考慮可能與樣本量較少有關。研究結果與Al-lnany[21]研究基本一致，發現長方案的臨床妊娠率高于拮抗劑方案。此外，朱潔茹等[22]研究也證實長方案的胚胎種植率顯著高于拮抗劑方案，尤其在年齡≥38歲和獲卵數≤5的人群中差異更為明顯。這可能的原因為長方案降調節后子宮內膜發生磷酸化和細胞因子調節作用，減少白細胞介素1和腫瘤壞死因子α等炎癥細胞因子的釋放，抑制子宮內膜炎癥，改善宮腔環境，提高子宮內膜容受性[23-24]，從而提高臨床妊娠率。考慮高齡患者更易出現卵泡發育異常及排卵障礙，在我中心的此類患者多選擇人工周期解凍移植，雖然長方案的累積胚胎種植率、累積臨床妊娠率和活產率都優于其他兩種方案，一方面可能是有賴于長方案增加了可移植胚胎數，另一方面優化了子宮內膜環境。但無論是任何方案，高齡患者卵巢儲備功能下降，卵母細胞質量降低均無法改善，所以，各組間的比較統計學差異并不明顯。在本研究中，子宮內膜薄或回聲不均和HCG日孕酮值的升高是取消鮮胚移植的主要原因，考慮拮抗劑有溶黃體作用[25]，并且高齡患者胚胎數量有限，所以拮抗劑方案的鮮胚移植取消率高于長方案，但兩組差異無統計學意義。

此外，研究還發現長方案組Gn的使用總量最高，使用Gn的天數也顯著長于其他兩組。由于垂體降調節后降低了FSH，同時高齡婦女卵泡數量少，卵泡募集的閾值隨之升高，對Gn反應性差，需要更高劑量及延長時間Gn的使用來改善卵泡的反應性是導致這一現象出現的主要原因[26-27]。盡管長方案促排卵時間略長，Gn使用劑量較多，但該方案和拮抗劑可以選擇鮮胚移植，縮短了達妊娠時間(Time to pregnant，TTP)。而PPOS方案無法鮮胚移植，TTP明顯長于其他兩組，增加了患者的治療費用和心理負擔。鑒于此，高齡卵巢低儲備人群在IVF -ET過程中是可以選擇長方案獲得較為理想的臨床結局。

4 結論與啟示

高齡卵巢低儲備患者可以選擇長方案作為輔助生殖技術的治療方案之一，在治療中可以獲得更高的可移植胚胎數、鮮胚妊娠率和累積臨床妊娠率。雖然本研究為高齡卵巢低儲備人群在輔助生殖促排卵方案中進行了初步探討，并提供了臨床指導和借鑒，但本研究為局部地區的小樣本回顧性研究，治療方案的選擇與醫生的臨床經驗有一定關系，結果的驗證性受到諸多尚未納入到本研究的因素影響，因此開展多中心的大樣本前瞻性研究將更加迫切。