康艾注射液體外對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響

顏 偉 王雅琦 陳潭琇

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的三分之一，每年約有150萬女性被確證為乳腺癌，具有高度侵襲、轉移和復發的特點[1]。我國乳腺癌發病率相對較低，但近年來發病率呈顯著上升趨勢，尤其是在上海、北京、天津及其他大城市[2]。據估計，乳腺癌在未來幾十年將成為我國女性發病率最高，對女性健康威脅最大的惡性腫瘤。因此，我們亟待尋找治療乳腺癌更為有效的方法[3]。近年來，隨著中藥應用的不斷推廣，眾多研究人員將關注點轉向抑制惡性腫瘤細胞生長的中藥研究，在研究工作當中人們發現康艾注射液是一種抗腫瘤中藥制劑，其副作用較小，可作為輔助藥物治療多種腫瘤，具有獨特的優勢[4]。本研究以乳腺癌細胞系MCF7細胞為研究對象，研究康艾注射液在體外對其凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

乳腺癌細胞系 MCF7購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。

1.2 試劑

DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶以及EDTA均購自美國 Gibco公司；FITC-Annexin V/PI試劑盒購自聯科生物公司；Caspase 3 抗體(1∶1000；#9661；Cell Signaling Technology，Inc.)PARP抗體(1∶1000； #9542；Cell Signaling Technology，Inc.)；β-actin抗體(1∶4000，A5316，Sigma)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 將細胞分3組，分別用0 mM、20 mM、40 mM康艾注射液處理48 h。

1.3.2 Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡 收集經康艾注射液處理過的細胞，3000×g室溫離心5 min。棄上清，加入500 μl 1× binding buffer重懸細胞，加入5 μl FITC標記Annexin V和10 μl PI室溫避光孵育5 min。樣品用流式細胞儀進行檢測。

1.3.3 Western Blot 用細胞裂解液(1% Triton X-100；10 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl； 0.25% sodium desoxycholate；5 mM EDTA，PH 7.4)裂解細胞，獲總蛋白。各組取15 μg總蛋白，采用10% SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜(Millipore，Bedford)，封閉液封閉1 h后，用一抗4 ℃過于孵育過夜，TBS-T清洗3次，用HRP標記二抗室溫孵育1 h?；瘜W發光顯影成像(Pierce，Rockford，IL，USA)。

1.4 統計學方法

應用SPSS軟件進行統計處理，兩組之間計量資料采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 康艾注射液促進乳腺癌MCF7細胞凋亡

采用Annexin-V/PI法檢測康艾注射液對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響。乳腺癌MCF7細胞經康艾注射液干預48 h后，細胞凋亡率明顯增高，且40 mM康艾注射液處理組凋亡率高于20 mM康艾注射液處理組凋亡率，差異具有統計學意義(P<0.05)。由此提示康艾注射液可促進乳腺癌MCF7細胞凋亡，見圖1。

圖1 康艾注射液對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響

2.2 康艾注射液通過調節凋亡相關蛋白表達促進凋亡

采用Western Blot檢測了康艾注射液對凋亡相關蛋白Caspase和PARP表達的影響。結果顯示，MCF7細胞經康艾注射液處理后cl-Caspase和cl-PARP表達水平增高，且40 mM康艾注射液處理組的表達水平高于20 mM康艾注射液處理組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 康艾注射液對乳腺癌MCF7細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

3 討論

隨著經濟的增長和生活水平的提高，我國乳腺癌的發病率和死亡率均呈上升趨勢。目前，臨床上乳腺癌的治療主要采用手術、化療、激素治療以及放療等方式，這些治療方式對乳腺癌具有較好療效，但也存在一些副作用，比如白細胞降低、嘔吐、劇烈疼痛等。我們知道部分傳統中藥具有抗腫瘤作用且副作用小，另外，傳統中藥抗腫瘤作用方式不是通過作用于單一靶點發揮功能，它們可能兼具增強免疫功能、下調VEGF表達、調控凋亡相關基因表達、逆轉腫瘤發生藥物耐受或者直接殺傷腫瘤的功能[5]。傳統中藥制劑康艾注射液，其主要成分為人參、黃芪和苦參素，臨床上作為化療輔助用藥應用較廣，目前已有研究報道康艾注射液在抗腫瘤、促進骨髓造血、提高機體免疫力及改善患者生存質量等方面具有確切的作用。陳日等人用康艾注射液處理肝癌細胞后，肝癌細胞的增殖能力減弱，G0/G1期和G2/M期細胞均減少，凋亡率增加，并且這種效應隨康艾注射液濃度的升高而增強[6]。體外研究表明康艾注射液能夠抑制人類乳腺癌細胞增殖，抑制克隆形成，誘導凋亡，Western Blot結果顯示其可能是通過影響AMPK/mTOR信號傳導通路促進乳腺癌細胞凋亡[7]。蔣益蘭等報道康艾注射液可有效改善老年晚期消化系統腫瘤患者的臨床癥狀、提高生活質量且具有較高的安全性[8]。另外，康艾注射液被報道還能夠用于治療結直腸癌、肺癌、肝癌及淋巴瘤化療引起的白細胞減少癥。有報道顯示脾氣虧虛型老年結直腸癌術后xelox方案輔助化療患者在應用康艾注射液后，患者主觀及客觀生活質量有所提高(KPS評分和QLQ-C30評分較對照組提高)，具有促白細胞和血紅蛋白的作用，同時可減輕化療所致骨髓抑制、消化道反應和神經系統反應[9]。

本研究以中醫藥理論為指導，旨在探討康艾注射液對乳腺癌MCF細胞凋亡的影響。實驗結果發現與對照組相比，康艾注射液處理后的MCF細胞凋亡率明顯升高，且40 mM劑量組細胞凋亡率高于20 mM劑量組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，MCF細胞在經過康艾注射液處理后cl-Caspase3 和cl-PARP表達水平明顯升高，且40 mM劑量組細胞凋亡率高于20 mM劑量組(P<0.05)。綜上所述，體外實驗顯示康艾注射液具有誘導乳腺癌MCF7細胞凋亡的功能，其主要通過促進凋亡相關蛋白cl-Caspase3 和cl-PARP的表達實現。本研究結果說明康艾注射液在乳腺癌治療方面具有一定的效果，為乳腺癌臨床治療方案選擇提供一定的指導意義。