基于TCGA數據庫研究KCNT2在肺腺癌中的表達及與患者預后的相關性

劉 翼 吳 強 楊龍海 周孜孜 張曉明 曾 薇

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤之首[1]。早期非小細胞肺癌患者缺乏特異癥狀且診斷方法有限，大多數患者被診斷時已處于腫瘤晚期，不適合進行手術切除，5 年生存期僅不足20%[2]。因此,確定與肺癌密切相關的新型分子靶點具有重大意義。KCNT2基因編碼鈉激活鉀通道蛋白SLICK，SLICK具有較大的單導性并被細胞內鈉離子和氯離子所激活，在細胞的去極化過程中表現出明顯的活化動力，有助于鉀離子向細胞外流動，從而降低和調節神經元的興奮性[3]。既往的研究表明KCNT2突變與癲癇性腦病的發生有關[4-6]。最近的研究發現，KCNT2在胃癌[7]、黑色素瘤[8]組織中低表達，并且和預后相關，提示KCNT2 可作為潛在的預后預測因子。然而,關于KCNT2 在肺腺癌中的表達變化及意義目前仍缺乏研究報道。本研究通過下載整理癌癥基因組圖譜(TCGA) 數據庫中2021 年5月30日之前納入的肺腺癌表達譜數據及患者臨床信息,分析KCNT2 在肺腺癌中的表達變化,探討KCNT2 與臨床病理特征及預后的相關性,并分析KCNT2 作用相關信號通路。

1 材料與方法

1.1 原始數據的下載及預處理

從TCGA 官方網站(https://portal.gdc.cancer.gov/) 檢索并下載肺腺癌的表達譜數據及相應臨床信息。其中,基因表達譜數據包括肺腺癌組織樣本497例,正常肺組織樣本59例，納入相關臨床樣本385例。整理RNA-seq樣本并使用R語言進行歸一化處理，同時對患者臨床數據進行篩選和整理，刪除臨床資料中失訪及目標信息不完整的病例。提取KCNT2單基因樣本及相對應的臨床資料樣本，分析目標基因在腫瘤和正常肺組織的表達差異。

1.2 KCNT2 表達與肺腺癌臨床病理特征及預后的相關性分析及驗證

從385例臨床樣本中選取性別、年齡、T 分期、N分期、 M分期、AJCC分期作為肺腺癌臨床病理特征指標，去除臨床病理特征缺失或者不完全的病例69例，以KCNT2 在肺腺癌組織中表達水平的中位值(0.143)為界限,將肺腺癌患者分為KCNT2 高表達組(150例)和KCNT2 低表達組(166例)，通過χ2檢驗比較兩組臨床病理特征的差異。根據在TCGA數據庫下載整理的肺腺癌患者的臨床信息,結合KCNT2表達量,利用單因素及多因素COX 分析KCNT2 表達與肺腺癌患者臨床病理特征相關性；將樣本KCNT2表達量和生存信息結合，分析KCNT2高表達組、低表達組總體生存率(OS)的差異；利用Kaplan-Meier Plotter在線數據庫對肺腺癌數據集進行生存分析，進一步驗證KCNT2的預后價值。

1.3 基因富集分析(GSEA)

應用GSEA 4.1.0版本軟件對應分析KCNT2高表達組和低表達組對相關基因的影響。選用GSEA中C2.cp.kegg.V7.4.symbols.gmt規范化基因集，運用缺省加權富集統計方法，每次分析對基因組進行1000次排列。

1.4 統計學方法

應用SPSS 25.0軟件，用Mann-Whitney U檢驗分析KCNT2在肺腺癌組織和肺正常組織樣本中的表達差異；對KCNT2表達水平與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性進行χ2檢驗；單因素及多因素COX比例風險回歸模型用于評價KCNT2與肺腺癌預后的關系；生存分析使用Kaplan-Mier法，生存曲線比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織、正常肺組織中KCNT2 表達水平的比較

KCNT2表達水平肺腺癌組織低于正常肺組織(P<0.01)(圖1)。在52對配對的肺腺癌組織與癌旁正常組織樣本中,腫瘤組織KCNT2 表達水平較癌旁正常肺組織也顯著下調(P<0.01)(圖2)。

圖1 TCGA-LUAD數據集中KCNT2在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達比較

圖2 TCGA-LUAD數據集中52對配對的肺癌組織和癌旁組織中KCNT2的表達比較

2.2 KCNT2基因表達與肺腺癌臨床病理特征及預后的關系

肺腺癌組織中KCNT2基因表達水平與患者年齡、性別、Stage分期、T分期、M分期、N分期無相關性(P>0.05)，與患者Stage分期相關(P<0.05)，見表1；單因素COX分析結果顯示,Stage分期、T分期、N分期均可以作為肺腺癌潛在的預后因素(P<0.01)；多因素COX回歸分析結果提示,Stage分期(HR=1.947,95% CI:1.236-3.066，P=0.004) 可以作為肺腺癌的獨立預后影響因素(表2)。

表1 KCNT2 基因表達與肺腺癌臨床病理特征的關系/例

表2 肺腺癌患者單因素和多因素 COX 回歸分析結果

2.3 KCNT2表達與肺腺癌預后的關系

KCNT2低表達與肺腺癌患者不良預后有關(P=0.035)(圖3)。KaplanMeier-plotter 在線數據庫分析結果表明,KCNT2低表達肺腺癌患者的OS 較低(P=0.017)(圖4)。

圖3 TCGA-LUAD數據集中KCNT2表達量與患者預后的關系

圖4 KaplanMeier-plotter 在線數據庫分析KCNT2表達量與患者預后的關系

2.4 KCNT2基因相關信號通路

KCNT2基因低表達樣本主要富集在氧化磷酸化信號通路、核糖體、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、RNA聚合酶等信號通路中(表3)。

表3 KCNT2的功能富集分析

3 討論

肺癌是全世界范圍內發生率和死亡率最高的腫瘤，肺腺癌屬于非小細胞肺癌的一類，是原發性肺癌中發生率最高的亞型，占到全部肺癌病例的40%且呈現持續上漲的趨勢[9]。由于缺乏早期臨床癥狀，很多肺癌患者確診時已進入進展期，治療效果不佳。發現新的分子標記物能夠對肺癌的診斷及治療提供理論依據，意義重大。

在電生理學或分子水平上有一類離子敏感性K離子通道，由細胞質Na離子升高而激活，這個家族，統稱為鈉激活鉀離子通道(KNa )。該通道首先在豚鼠心肌細胞中被鑒定[10]，隨后，在各種神經元中報道了該通道[11-12]。KCNT1(SLACK)與 KCNT2(SLICK)同為編碼鈉激活鉀離子通道家族蛋白的基因，有76%的結構相似性，兩者共同形成一個四聚體通道，介導一系列神經元細胞的鈉敏感性鉀電流[13]。KCNT1 編碼鈉激活鉀離子通道(KNa )，是目前已知最大的鉀通道亞單位，在神經系統中廣泛表達，參與癲癇的發病機制[14]。KCNT2和KCNT1具有類似的單通道電導作用，也可以通過細胞外Na離子激活。人類KCNT2基因約為400 kb，與大鼠氨基酸序列具有98%的同源性，表現出很強的進化保守性。與KCNT1相比，KCNT2通道對細胞內氯化物更敏感，KCNT2激活非常迅速[15]。研究顯示，與KCNT1通道相比，KCNT2通道是唯一對細胞體積微小變化敏感的鉀通道[16]。Danielle等研究顯示KCNT2的表達受NFκB的控制,由于神經元NFκB的激活發生在缺氧和損傷等應激刺激過程中，因此KCNT2是一個神經保護基因[17]。最近的研究表明，KCNT2在一些腫瘤組織中也存在異常表達的情況，Lan等研究發現，胃癌組織及細胞系中KCNT2低表達，在胃癌細胞系中過表達KCNT2，可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[7]。我們的研究采用 TCGA 肺腺癌數據庫分析正常肺組織與肺腺癌組織中KCNT2基因表達差異，并用臨床數據分析其表達與預后的關系,發現肺腺癌組KCNT2 的表達水平低于正常對照組(P<0.05)；KCNT2 低表達組生存率低于KCNT2 高表達組(P=0.035)；單因素、 多因素 Cox 分析表明Stage 分期(HR=1.947,95% CI:1.236～3.066，P=0.004)可以作為肺腺癌的獨立預后因素。GSEA分析首先運用預定義的基因集，將基因按照在兩組樣本中的表達差異程度進行排序，而后檢驗預定義的基因集是否富集在排序表的頂端或者底部，是當下研究基因表達差異富集信號通路的理想生物信息學方法。本研究利用GSEA方法預測KCNT2可能的調控信號通路，發現KCNT2 基因低表達樣本主要富集在氧化磷酸化信號通路、核糖體、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、RNA聚合酶等信號通路中。

綜上所述,肺腺癌組織中 KCNT2 基因低表達,且與預后相關,可能是肺腺癌診斷和治療的潛在生物標志物。 本研究利用 TCGA 數據庫中肺腺癌的測序數據,納入大量樣本,臨床資料相對完整,為后續研究KCNT2基因在肺腺癌中的發生機制及相關臨床研究提供依據。在后續的研究中，課題組將采用 qPCR、Western blot和免疫組織化學法驗證KCNT2(SLICK)的表達情況,并進一步研究其作用機制,為肺腺癌的基因靶向治療提供新思路。