普洱茶素II改善高脂血癥ApoE?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究

王鑫玉，趙一慕，高 云，陰紫鈺，王凌瀟，馬家樂(lè)，趙云芳，鄭 姣，李 軍

普洱茶素II改善高脂血癥ApoE?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究

王鑫玉1, 2，趙一慕1, 2，高 云1, 2，陰紫鈺1, 2，王凌瀟1, 2，馬家樂(lè)1, 2，趙云芳1，鄭 姣1*，李 軍1, 2*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院中藥現(xiàn)代研究中心，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

研究普洱茶素II對(duì)高脂血癥誘發(fā)動(dòng)脈硬化ApoE基因敲除小鼠（ApoE?/?）的治療效果及作用機(jī)制。ApoE?/?小鼠通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，造模成功后將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀（30 mg/kg）組和普洱茶素II低、高劑量（50、100 mg/kg）組，給藥6周后檢測(cè)小鼠血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）水平，以及主動(dòng)脈流出道斑塊面積等指標(biāo)的差異。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和人外周血單核細(xì)胞THP-1，檢測(cè)普洱茶素II對(duì)氧化低密度脂蛋白（oxidized low density protein，ox-LDL）誘發(fā)單核與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響，利用Western blotting對(duì)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/血管細(xì)胞黏附因子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）通路相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。普洱茶素II顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)ApoE?/?小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)、附睪脂肪質(zhì)量和附睪脂肪指數(shù)（＜0.05、0.01），降低血漿TC、TG、non-HDL-C水平（＜0.05、0.01），升高HDL-C水平（＜0.05），減少主動(dòng)脈流出道脂質(zhì)沉積。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，普洱茶素II顯著抑制HUVEC與THP-1細(xì)胞間的黏附（＜0.05），抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中VCAM-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）。普洱茶素II能夠顯著改善ApoE?/?小鼠的肥胖、脂代謝紊亂、主動(dòng)脈斑塊沉積，通過(guò)調(diào)控Akt/NF-κB/VCAM-1通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

普洱茶素II；高脂血癥；ApoE?/?；脂代謝異常；動(dòng)脈粥樣硬化；蛋白激酶B/核因子-κB通路

動(dòng)脈粥樣硬化是由于膽固醇、脂肪及其他物質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)、外壁積聚形成斑塊的病理過(guò)程，是心腦血管疾病最重要的誘發(fā)因素之一[1]。動(dòng)脈粥樣硬化的病因復(fù)雜，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的參與。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞與血液循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞的黏附被認(rèn)為是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。血液中的低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）富含膽固醇并極易被氧化修飾為氧化低密度脂蛋白（oxidized low density protein，ox-LDL）。血液中積累的ox-LDL刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而增加細(xì)胞黏附因子如血管細(xì)胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）與單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達(dá)。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞受到內(nèi)皮黏附因子的招募后，與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附并侵入到血管內(nèi)皮下成為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL成為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞不斷累積成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[3]。因此，抑制ox-LDL誘發(fā)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

普洱茶是以云南特產(chǎn)的普洱茶(Mast.) Chang的干燥嫩葉為原料，加工而成的微生物后發(fā)酵茶。其茶葉經(jīng)過(guò)酶解、揉捻、曬干和軋制，然后在蒸煮、壓制和后發(fā)酵（自然陳化或堆積發(fā)酵）中成型。后發(fā)酵過(guò)程中，微生物和微生物酶將碳水化合物和酚類(lèi)化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使普洱茶形成獨(dú)特的口感和風(fēng)味[4]。研究表明，普洱茶具有改善糖脂代謝紊亂、調(diào)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等多種生物活性[5-7]。普洱茶富含黃酮類(lèi)、兒茶素類(lèi)、酚酸類(lèi)黃烷醇聚合物、嘌呤類(lèi)生物堿、可水解鞣質(zhì)等多種活性成分[8-10]。特別是在高溫高濕的后發(fā)酵過(guò)程中，普洱茶嫩葉中的主要成分茶多酚發(fā)生各種反應(yīng)，形成多種兒茶素和有機(jī)酸類(lèi)似物。本課題組前期對(duì)普洱茶進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，分離鑒定了35個(gè)化合物，獲得多個(gè)新化合物，并證實(shí)新化合物普洱茶素I～I(xiàn)V是普洱茶后發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝產(chǎn)物[5,11-12]。為了深入研究普洱茶改善脂代謝紊亂及動(dòng)脈粥樣硬化的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，選擇含量較高的特征性成分普洱茶素II，利用體內(nèi)和體外模型探討其作用機(jī)制，為普洱茶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6背景ApoE?/?小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。SPF級(jí)高脂飼料于北京科奧協(xié)力公司定制，飼料配方為基礎(chǔ)飼料添加0.2%膽固醇，15%豬油。實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)環(huán)境室溫保持在21～24 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～60%，12 h明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)No.BUCM-4-2016040301-2001）。

1.2 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和人外周血單核細(xì)胞THP-1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.3 藥品與試劑

普洱茶素II由藥明康德公司合成，其結(jié)構(gòu)的光譜數(shù)據(jù)（1H NMR和13C NMR）與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)[7]比較得到驗(yàn)證，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；DMEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液（批號(hào)18721015）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RPMI 1640細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液（批號(hào)8122261）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)12483020）、0.25%胰酶（批號(hào)25200072）、雙抗（批號(hào)15140163）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ox-LDL（批號(hào)2018-10-25）購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；DAPI（批號(hào)190821）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號(hào)9271T）、磷酸化核因子-κB（phosphorylated nuclear factor-κB，p-NF-κB）抗體（批號(hào)3033P）、NF-κB抗體（批號(hào)8242P）購(gòu)自美國(guó)CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)HRP-60004）、Akt抗體（批號(hào)10176-2-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；MCP-1抗體（批號(hào)22115）購(gòu)自美國(guó)Novus公司；VCAM-1抗體（批號(hào)EPR5047）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（批號(hào)7076P2）、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)7074P2）購(gòu)自美國(guó)Santa公司；三酰甘油（triglycerides，TG）測(cè)定試劑盒（批號(hào)218081）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒（批號(hào)212072）購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器

MCO-18AIC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、SIM-F140AY65型制冰機(jī)（日本Sanyo公司）；5810R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；EnSpire型多模式微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；Mini PROTEAN型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；FACSCanto II型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；FV1000型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ICC50HD型光學(xué)顯微鏡、CM1950型冷凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 造模、分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）、模型組（8只）、阿托伐他汀（30 mg/kg）組（7只）和普洱茶素II低、高劑量（50、100 mg/kg）組（各7只）。除對(duì)照組給予正常飼料外，其他各組用高脂飼料喂養(yǎng)2周造成高脂模型后，開(kāi)始ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)6周，給藥同時(shí)維持高脂飲食。

2.1.2 小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量的測(cè)定及主動(dòng)脈流出道取材 各組小鼠給藥6周后，禁食不禁水6 h，稱(chēng)定小鼠質(zhì)量、眼眶取血，全血肝素抗凝后4000 r/min離心10 min，取上清血漿備用。小鼠麻醉后將其四肢固定于操作板，打開(kāi)胸腔使心臟暴露，右心房剪小角，灌流針頭稍插入心尖處，經(jīng)左心室逆行灌流PBS緩沖液，心臟充盈后右心耳剪孔使血液流出。灌流結(jié)束后摘取肝臟和附睪脂肪稱(chēng)定質(zhì)量。從頭臂干主動(dòng)脈起剝至骸總動(dòng)脈分叉處整體剝離心臟及整個(gè)腹主動(dòng)脈，于4%多聚甲醛中固定。肝臟/附睪脂肪指數(shù)以肝臟/附睪脂肪和體質(zhì)量的比值計(jì)算。

2.1.3 血漿中血脂水平的測(cè)定 小鼠血漿TC和TG按照TC和TG檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，血漿高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）利用聚乙二醇沉淀法[13]進(jìn)行測(cè)定，非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）含量由TC扣除HDL-C的含量計(jì)算得到。

2.1.4 心主動(dòng)脈流出道切片油紅O染色 將心臟的冰凍包埋塊固定于冰凍切片機(jī)上，從心底向主動(dòng)脈開(kāi)口方向進(jìn)行連續(xù)切片，至出現(xiàn)主動(dòng)脈瓣膜，以7 μm厚度收集連續(xù)切片，至主動(dòng)脈瓣膜消失，每間隔10張切片進(jìn)行油紅O染色，細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染，顯微鏡采集圖像后對(duì)主動(dòng)脈流出道的動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)行組織學(xué)觀察，用Image J軟件對(duì)斑塊面積進(jìn)行測(cè)量。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%，用含2%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和給藥組。對(duì)照組用含2%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組及各給藥組以添加50 μg/mL ox-LDL的含2%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，給藥組以100 μL不同濃度（50、100 μmol/L）的普洱茶素II處理細(xì)胞24 h。THP-1細(xì)胞用含2.5 μmol/L的BCECF AM熒光染料的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含血清）進(jìn)行標(biāo)記，37 ℃恒溫避光孵育30 min，1000 r/min離心5 min，棄去上清，PBS洗滌細(xì)胞3次去除未標(biāo)記BCECF AM熒光染料，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。將已標(biāo)記的THP-1細(xì)胞20 μL輕柔加入至上述用于實(shí)驗(yàn)的HUVEC細(xì)胞中，于37 ℃共孵育30 min后吸去上清，用PBS輕柔清洗2次以除去未黏附于HUVEC細(xì)胞上的THP-1細(xì)胞。熒光倒置顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的黏附情況。每個(gè)樣品孔隨機(jī)取10個(gè)視野進(jìn)行拍照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用Image J軟件對(duì)其黏附程度進(jìn)行定量分析。

2.2.2 Western blotting檢測(cè)Akt/NF-κB/VCAM-1通路相關(guān)蛋白表達(dá) HUVEC細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后至細(xì)胞融合度達(dá)到80%。按照細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)ox-LDL（50 μg/mL）刺激與普洱茶素II（10、50、100 μmol/L）處理HUVEC細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液200 μL，待細(xì)胞裂解后于95 ℃將蛋白變性，離心取上清置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠方?jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入VCAM-1、MCP-1、p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH抗體，TBST洗滌后，加入二抗孵育，用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液曝光條帶，顯影后用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 普洱茶素II對(duì)ApoE?/?小鼠體質(zhì)量、肝臟與附睪脂肪質(zhì)量及指數(shù)的影響

脂代謝紊亂與肥胖、脂肪肝等疾病密切相關(guān)。如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)、附睪脂肪質(zhì)量和附睪脂肪指數(shù)均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，普洱茶素II高劑量組和阿托伐他汀組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量與指數(shù)、附睪脂肪質(zhì)量與指數(shù)均顯著降低（＜0.05、0.01），普洱茶素II低劑量組小鼠肝臟質(zhì)量顯著降低（＜0.05）。表明普洱茶素II能夠顯著抑制高脂血癥小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及體脂含量。

3.2 普洱茶素II對(duì)ApoE?/?小鼠血脂的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血漿TC、TG、non-HDL-C水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血漿TC、TG、non-HDL-C水平均顯著降低（＜0.05、0.01），普洱茶素II高劑量組和阿托伐他汀組HDL-C水平顯著升高（＜0.05），表明普洱茶素II能夠顯著改善脂代謝異常。

3.3 普洱茶素II對(duì)ApoE?/?小鼠心臟主動(dòng)脈流出道斑塊面積的影響

ApoE?/?小鼠經(jīng)過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)后可自發(fā)產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化。主動(dòng)脈流出道連續(xù)切片定量是評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化程度的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，因此采用流出道斑塊沉積的比較，驗(yàn)證普洱茶素II對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠心臟主動(dòng)脈流出道斑塊面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠主動(dòng)脈流出道斑塊面積均顯著減少（＜0.05、0.01）。表明普洱茶素II能夠顯著抑制高血脂誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 普洱茶素II對(duì)ApoE?/?小鼠血漿TC、TG、HDL-C和non-HDL-C水平的影響(, n = 6～8)

箭頭為斑塊

3.4 普洱茶素II抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附

ox-LDL誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附，是動(dòng)脈粥樣硬化的最重要誘因之一。因此，本研究利用血管HUVEC細(xì)胞和單核THP-1細(xì)胞構(gòu)建體外模型，探討普洱茶素II對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。如圖4所示，ox-LDL刺激后HUVEC細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的黏附作用顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的黏附（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。表明普洱茶素II對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的單核與內(nèi)皮細(xì)胞黏附有顯著的抑制作用。

圖4 普洱茶素II對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞與THP-1細(xì)胞黏附的影響(, n = 6)

3.5 普洱茶素II對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子蛋白表達(dá)的影響

ox-LDL通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子和趨化因子，募集單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附進(jìn)而形成動(dòng)脈粥樣硬化。如圖5所示，ox-LDL刺激HUVEC細(xì)胞24 h后，HUVEC細(xì)胞中VCAM-1和MCP-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），普洱茶素II（50、100 μmol/L）顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中VCAM-1和MCP-1蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。表明普洱茶素II可能是通過(guò)抑制VCAM-1和MCP-1的表達(dá)來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附。

3.6 普洱茶素II對(duì)HUVEC細(xì)胞Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙在心血管疾病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而炎癥引起的內(nèi)皮損傷是內(nèi)皮功能障礙的主要誘因。如圖6所示，ox-LDL刺激后Akt和NF-κB的磷酸化水平顯著升高（＜0.01），100 μmol/L普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞Akt和NF-κB的磷酸化水平（＜0.01），50 μmol/L普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞NF-κB的磷酸化水平（＜0.05），表明普洱茶素II通過(guò)Akt/NF-κB通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖5 普洱茶素II對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞中VCAM-1、MCP-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖6 普洱茶素II對(duì)ox-LDL刺激的HUVEC細(xì)胞中Akt、NF-κB蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響(, n = 3)

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，包括脂質(zhì)浸潤(rùn)、炎癥損傷、氧化應(yīng)激等方面，其主要成因是動(dòng)脈壁脂代謝改變導(dǎo)致的脂質(zhì)堆積[14]。目前普洱茶提取物對(duì)高脂血癥、糖尿病的治療作用研究已有報(bào)道。如普洱茶水提物、醋酸乙酯萃取組分對(duì)肥胖ICR小鼠體質(zhì)量、體脂降低作用明顯[15]；普洱茶水提物能夠促進(jìn)Wistar大鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，改善大鼠胰島素抵抗等[16]。但是普洱茶活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究利用前期課題組發(fā)現(xiàn)的普洱茶特征性成分普洱茶素II，系統(tǒng)研究其改善高脂血癥誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的體內(nèi)藥效與作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)普洱茶素II能呈劑量相關(guān)性地降低小鼠的TC、TG和non-HDL-C水平，減少附睪脂肪質(zhì)量，抑制主動(dòng)脈流出道的脂質(zhì)沉積，能降低其體內(nèi)血脂和動(dòng)脈粥樣硬化水平。

動(dòng)脈粥樣硬化是血管壁的慢性炎性疾病。它源于修飾的脂蛋白、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。因此內(nèi)皮功能障礙和單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。LDL-C經(jīng)氧化修飾形成ox-LDL，ox-LDL不同于天然LDL-C，它可激活損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使細(xì)胞趨化因子、黏附分子和集落因子分泌，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附[17]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷炎癥激活時(shí)，選擇素、VCAM-1和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)增加，促進(jìn)單核細(xì)胞的黏附[18-19]，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶素II能顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞的黏附，并抑制了ox-LDL刺激的HUVEC細(xì)胞中VCAM-1和MCP-1的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞中黏附因子的表達(dá)受多個(gè)通路調(diào)控，其中Akt/NF-κB通路是調(diào)控炎癥因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的重要炎癥通路[20]。本研究結(jié)果顯示，普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞中Akt和NF-κB的磷酸化激活。推測(cè)普洱茶素II通過(guò)Akt/NF-κB通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而抑制黏附因子的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

綜上，本研究表明，普洱茶素II作為普洱茶的特征成分能夠顯著改善ApoE?/?小鼠的肥胖、脂代謝紊亂和主動(dòng)脈斑塊沉積。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，針對(duì)ox-LDL誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附，普洱茶素II通過(guò)調(diào)控Akt/NF-κB炎癥通路，抑制MCP-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，推測(cè)普洱茶素II是普洱茶改善脂代謝紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of puerin II on improving atherosclerosis in ApoE?/?mice with hyperlipidemia

WANG Xin-yu1, 2, ZHAO Yi-mu1, 2, GAO Yun1, 2, YIN Zi-yu1, 2, WANG Ling-xiao1, 2, MA Jia-le1, 2, ZHAO Yun-fang1, ZHENG Jiao1, LI Jun1, 2

1. Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the therapeutic effect and mechanism of puerin II on ApoE?/?mice with hyperlipidemia induced atherosclerosis.ApoE?/?mice were fed high-fat diet to establish atherosclerotic animal models. After successful modeling, mice were randomly divided into control group, model group, atorvastatin (30 mg/kg) group and puerin II low-and high dose (50, 100 mg/kg) groups. After 6 weeks of administration, the difference of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and non-high density lipoprotein cholesterol (non-HDL-C) levels, as well as plaque area of aortic sinus were detected. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human peripheral blood mononuclear cells (THP-1) were cultured. The effects of puerin II on adhesion of monocytes to endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) were detected. Western blotting was used to detect protein kinase B (Akt)/nuclear factor-κB (NF-κB)/vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) pathway related protein expressions was detected.Puerin II significantly inhibited the body weight, liver weight, liver index, epididymal fat weight, and epididymal fat index (< 0.05, 0.01), decreased TC, TG, and non-HDLc levels in plasma (< 0.05, 0.01), increased HDL-C level (< 0.05), reduced lipid deposition in aortic sinus.experiments confirmed that puerin II significantly inhibited the adhesion between HUVEC and THP-1 cells (< 0.05), inhibited VCAM-1, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and Akt/NF-κB pathway related protein expressions in HUVEC cells induced by ox-LDL (< 0.05, 0.01).Puerin II can significantly improve the obesity, lipid metabolism disorder, and aortic plaque deposition of ApoE?/?mice by regulating Akt/NF-κB/VCAM-1 pathway, inhibit the adhesion of endothelial cells and monocytes, thereby inhibiting the occurrence and development of atherosclerosis.

puerin II; ApoE?/?; hyperlipidemia; abnormal lipid metabolism; atherosclerosis; protein kinase B/nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1157 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.015

2022-10-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074050）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706400）

王鑫玉（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。E-mail: wxywukong@163.com

鄭 姣，碩士生導(dǎo)師，副研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: zj98v2@163.com

李 軍，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究。E-mail: drlj666@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]